蒎烯是一种自然界中存在的双环单萜类化合物,具有广泛的应用。蒎烯的两种同分异构体α-蒎烯和β-蒎烯二聚化后会形成具有极高能量密度的化合物,能够充当航天燃料。生产蒎烯的传统工业方法是作为造纸和提炼松节油的副产物,过程中需要消耗大量的原材料,且产量较低。为降低蒎烯的合成成本、提高产量,开发新的合成途径是十分必要的。目前,已有人构建了利用大肠杆菌合成蒎烯的方法,但所达到的滴度还只有32 mg/L[1]。对此,本文通过开发新的合成生物学手段来提高蒎烯的生物合成滴度。首先,为提高大肠杆菌与外源蒎烯合成途径之间的兼容性,克服因蒎烯合成对宿主造成的代谢负担而导致的宿主自发性破坏合成途径的问题,我们采取了包括替换同源标志序列、变换基因元件位置以及干扰内源重组通路等方法,使蒎烯合成途径的表达质粒能够长时间稳定地在大肠杆菌中表达与复制。其次,通过过表达蒎烯合成途径中的外源导入部分——甲羟戊酸途径中的酶,同时监测底物变化,我们发现了甲羟戊酸激酶与焦磷酸甲羟戊酸脱羟酶是限速酶,将它们过表达后能显著提高蒎烯合成滴度。在此基础之上,我们开发了一种动态抑制大肠杆菌基因表达的方法。我们利用费氏弧菌中的Lux群体感应系统来控制原核小RNA的转录,使得任何被靶向的目的基因的表达水平会随着细胞密度的增大而减小。通过优化,对原本持续表达的绿色荧光蛋白的抑制程度从接种时的0逐渐增加至平台期的90%。不仅如此,我们还将此策略延伸至同时抑制多个基因表达的层面上,希望能更好的控制大肠杆菌的代谢网络。通过与传统的持续抑制策略进行比较,动态抑制策略能在不影响宿主生长的条件下,在平台期强烈的抑制必需基因的表达,从而提高目的产物的滴度。通过利用动态抑制策略,我们成功挖掘到了多个内源基因,当动态抑制这些基因时蒎烯的滴度显著提升至128.4 mg/L。我们最后还证明,对于蒎烯合成来说,还原性辅酶II是比乙酰辅酶A更为紧缺的原料。我们希望此策略还能用于解决其他代谢工程问题。