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背景多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是常见的妇科内分泌疾病,为育龄期妇女无排卵性不孕症的主要原因之一。以雄激素过高的临床或生化表现、稀发排卵或持续无排卵、卵巢多囊改变为特征,且常伴有胰岛素抵抗、脂质代谢异常。PCOS发病机制复杂,涉及遗传、环境及代谢等因素,目前尚未完全阐明。微小RNA(micro RNA,miRNA)是一类真核生物体内的非编码小RNA,长度约在18-24个核苷酸,广泛存在于体内生理病理活动,如生长、炎症、繁殖与代谢等。Mi RNA虽不能直接编码蛋白,但可以与靶基因m RNA的3’非翻译区结合,抑制m RNA的翻译,从而发挥调控基因表达的作用。Mi R-let-7家族是miRNA的成员,可以调控卵泡发育成熟,调节类固醇激素水平,与女性生殖系统密切相关。卵巢颗粒细胞分布于卵母细胞周围,可以合成多种性激素,对卵泡发育有重要影响。颗粒细胞的异常改变会导致卵泡发育异常,影响正常卵巢功能,导致PCOS的发生。Mi RNA在PCOS患者的颗粒细胞生物活动中起重要作用,有越来越多的研究证实miRNA参与PCOS的发生发展。例如miRNA-200b、miRNA-200c在PCOS患者颗粒细胞中表达上调,miRNA-200b、miRNA-200c可以抑制人卵巢颗粒细胞株KGN细胞的增殖能力,造成颗粒细胞异常增殖,是PCOS潜在的发病原因。Mi RNA家族庞大,数量众多,需进一步挖掘与PCOS相关的miRNA,为更好地揭示其发病机制带来新的基础铺垫。目的分析PCOS患者颗粒细胞的miRNA表达情况,找寻PCOS患者体内差异表达的miRNA,研究miRNA对人卵巢颗粒细胞株KGN细胞功能的影响,并对miRNA的靶基因及相关信号通路进行研究,为探索PCOS发病机制提供新的思路依据。材料与方法收集23例行IVF/ICSI助孕的PCOS患者作为实验组,同时收集20例因输卵管或男方因素行IVF/ICSI助孕的非PCOS患者作为对照组。再在各组分别收集3例病例,利用新一代测序技术对其颗粒细胞进行miRNA深度测序分析,得到miRNA表达谱。选取测序表达谱中存在显著差异(P<0.05)且相对表达水平较高的6个miRNA,运用RT-q PCR技术对测序所得的miRNA进行临床样本验证,得到存在统计学差异的miRNA。然后在KGN细胞中进行miRNA的si RNA小干扰处理,研究miRNA对KGN细胞功能的影响。接着利用生物信息技术预测分析miRNA靶基因,查找靶基因相关信号通路,在KGN细胞中si RNA处理后,运用双荧光素酶报告基因实验检测miRNA是否直接结合靶基因,RT-q PCR、Western Blot实验研究miRNA对靶基因及相关信号通路的调控作用。结果(1)通过对两组颗粒细胞的miRNA深度测序分析,得到72种存在表达差异的miRNA,其中包括10种上调的miRNA及62种下调的miRNA。(2)Mi R-let-7d-3p在PCOS患者卵巢颗粒细胞中表达显著升高(P=0.0091),miRNA-134-5p 、 miRNA-181a-5p 、 miRNA-328-3p 、 miRNA-409-3p 、miRNA-493-3p在两组中表达无明显差异。(3)CCK-8法显示mi R-let-7d-3p过表达可以抑制KNG细胞增殖。(4)Mi R-let-7d-3p能直接结合靶基因TLR4,抑制TLR4的m RNA及蛋白的表达,并抑制Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达。结论(1)PCOS患者卵巢颗粒细胞中的mi R-let-7d-3p表达显著升高。(2)Mi R-let-7d-3p可能通过Wnt/β-catenin信号通路调控靶基因TLR4,从而抑制卵巢颗粒细胞增殖,进而在PCOS发病机制中发挥作用。