论文部分内容阅读
目的:心血管疾病是引发糖尿病患者死亡的首要原因,如何有效减少糖尿病患者的心血管死亡一直是临床关注的焦点。对于糖尿病心血管并发症的防治不仅要强调多重危险因素综合干预,而且也应注意药物本身的心血管安全性。二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidaseⅣ,DPP4）抑制剂,通过提高内源性GLP-1水平发挥降糖效应且有研究提示具有一定的心肌保护作用,但具体机制不详。糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy,DCM）发病机制复杂,除了氧化应激和心肌细胞凋亡等可能机制外,自噬在DCM中的作用日益受到关注。另有研究发现多种miRNA通过不同机制参与DCM的病理生理过程,miRNA可能是调节糖尿病诱导心脏疾病的潜在干预靶点。本研究以高脂饮食/链脲佐菌素（STZ/HFD）诱导的C57BL/6J及miR-21-/-小鼠、大鼠心肌细胞系（H9C2）为研究对象,通过动物体内实验和细胞实验旨在探讨:1.维格列汀对STZ/HFD诱导的C57小鼠糖尿病心肌病变的预防作用及安全性;2.microRNA-21对糖尿病心肌自噬的调控作用;3.维格列汀通过调节miR-21预防糖尿病心肌病变及作用机制。方法:1.动物水平:以C57小鼠以及miR-21-/-小鼠作为研究对象,将C57小鼠随机分为正常对照组（NC）、糖尿病组（DM）、维格列汀干预组（DM+Vild）、维格列汀干预并注射过表达miR-21腺相关病毒组（DM+AVV9+Vild）、维格列汀干预注射空载病毒组（DM+AAV9 NC+Vild）组。将miR-21-/-小鼠随机分为miR-21-/-NC组和miR-21-/-DM组。维格列汀干预10周后,检测小鼠肝脏、肾脏功能;超声心动检测小鼠心脏功能,评估维格列汀对小鼠糖尿病心肌病变的改善作用及安全性;观察小鼠心脏组织形态学变化;应用免疫组化以及western blot检测心脏电生理因子（connexin 43）、自噬功能（LC3、P62）及相关调节因子蛋白（PTEN、Akt、mTOR）的表达变化;应用qRT-PCR法检测维格列汀对各组小鼠心脏组织miR-21a-5p水平的影响。2.细胞水平:以H9C2为研究对象,分为正常糖浓度组（5.5mM）、25mM糖浓度组、33mM糖浓度组以及渗透压对照组,分别培养24h、48h、72h,qRT-PCR法检测miR-21表达,确定适宜高糖浓度和培养时间,以及高糖状态下H9C2细胞miR-21表达变化;Western Blot法检测细胞高糖状态下通路蛋白PTEN/AKT/mTOR表达;细胞转染miR-21 mimics和inhibitor进行add-back rescue实验,western blot法检测通路信号分子的蛋白表达变化。从基因水平探讨miR-21在糖尿病心肌病变中的可能作用及相关机制。结果:一、维格列汀对STZ/HFD诱导的C57小鼠糖尿病心肌病变的作用;1.22周末处死小鼠前DM组小鼠超声心动示E/A为1.05±0.02,左室射血分数LVEF为46.42±3.00,以及左室短轴缩短率LVFS均较NC组降低（P<0.05）;左室壁收缩末期厚度LVID;s为3.32±0.27,较NC组升高（P<0.05）。HE染色示DM组心肌组织排列不规则,细胞肿胀明显。Masson染色示心肌组织内胶原含量明显增多。判定糖尿病心肌病变造模成功。2.维格列汀可降低糖尿病小鼠血糖水平,同时对小鼠体重、肝肾功能未见明显影响。干预后超声心动图结果示心脏功能较DM组高,E/A、LVEF、LVFS均较DM组高（P<0.05）,LVID;s较DM组低（P<0.05）。HE染色观察组织形态,细胞排列较DM组整齐规则,细胞肿胀较轻;Masson染色示维格列汀干预组心脏组织纤维化较少。二、microRNA-21调节糖尿病心肌自噬的作用;1.qRT-PCR检测结果示DM组小鼠miR-21表达高于NC组。大鼠心肌细胞系（H9C2）高糖（33mM Glu）干预,qRT-PCR检测结果为高糖条件下miR-21表达较正常糖（5.5mM）组升高。2.miR-21-/-NC组小鼠随机血糖低于C57 NC组小鼠（P<0.05）;miR-21-/-DM组小鼠空腹及随机血糖低于C57 DM组小鼠（P<0.05）,同时体重、肝肾功能未见明显变化。miR-21-/-DM组小鼠E/A值较C57 DM组高,LVID较C57 DM组低（P<0.05）。3.HE染色示miR-21-/-DM组小鼠心肌结构较C57 DM组小鼠整齐,细胞肿胀较轻;Masson染色示纤维化程度较轻。4.免疫组化法及Western Blot检测均显示miR-21-/-DM组小鼠心脏组织connexin 43较C57 DM组小鼠表达增多,P62减低,LC3表达增高（P<0.05）。三、维格列汀作用于miR-21改善糖尿病心肌病变的通路机制1.H9C2细胞33mM Glu培养72h,Western Blot检测示PTEN表达明显降低（P<0.05）,p-AKT、p-mTOR表达明显升高（P<0.05）。2.H9C2细胞转染miR-21 mimics 72h后,Western Blot检测结果示,较HG干预组,PTEN表达降低,p-AKT、p-mTOR表达升高（P<0.05）;H9C2细胞转染miR-21 inhibitor后,Western Blot检测结果示,较HG干预组,PTEN表达升高,p-AKT、p-mTOR表达降低（P<0.05）。3.DM+Vild+AAV9组小鼠与DM+Vild组小鼠相比,空腹血糖及随机血糖有上升趋势,但未见统计学差异;同时体重、肝肾功能未见明显差异（P>0.05）。4.Western Blot检测,DM+Vild+AAV9组小鼠较DM+Vild组小鼠心脏组织P62表达明显升高,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达明显降低（P<0.05）;PTEN表达明显降低,p-AKT、p-mTOR表达显著增高（P<0.05）。结论:1.维格列汀可预防糖尿病心肌病变,减轻心肌细胞肥大及纤维化;可使E/A值、LVEF及LVFS升高,LVID;s降低,增强DM小鼠心脏功能。2.miR-21敲除可通过增强心肌自噬,增加cx43的表达,从而预防糖尿病心肌病变,保护心脏功能。3.维格列汀可通过抑制miR-21的表达,进而激活PTEN/AKT/mTOR通路,提高心肌织自噬水平,增加cx43的表达,预防糖尿病心肌病变。