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在本研究室建立的香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)4号小种快速检测技术的基础上,进一步优化PCR反应体系和反应条件,从而建立了更为稳定灵敏的4号小种检测技术,同时,运用同样的方法建立了香蕉枯萎病菌1号小种的快速检测技术。另外,本研究从不同地区4号小种菌株生物学特性及ITS序列分析入手,比较不同地区4号小种菌株的单核苷酸共性差异。取得的主要研究结果如下:
1、通过随机选取110个随机引物扩增香蕉枯萎病菌4号小种的模板DNA,从中筛选出多态性好的引物,用优化的反应体系对4号小种及其近似菌株番茄枯萎病菌(Eoxysporum f.sp.lyscopersici)、棉花枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.vasinfectum)等进行多态性分析。随机引物S1扩增香蕉枯萎病菌4号小种得到一条特异想DNA条带,特异性。DNA片段大小分别为900bp。根据特异性DNA片段的序列设计出针对4号的特异性引物TQ-M/V。用这对引物扩增出香蕉枯萎病菌4号小种的DNA特异性片段,将RAPD分子标记转化大小为600bp的SCAR标记。通过回检,结果表明,检测特异性、稳定性和灵敏型较好。该方法能够检测到相当于1ng的新鲜菌丝。用所建立的鉴定体系,能从广东省和云南省各地区的显症香蕉样品中检测到香蕉枯萎病菌4号小种。并且,在伤根接种后20天的未显症的巴西蕉苗的根、茎组织中也检测到了4号小种,而在叶片组织中未检测到特异性条带,该引物可用做香蕉枯萎病菌4号小种的特异性SCAR标记。本实验结果为香蕉枯萎病菌快速检测技术体系的进一步发展奠定了基础。
2、本研究随机选取110个随机引物扩增1号小种的模板DNA,从中筛选出多态性好的引物,用优化的反应体系对1号及其近似菌株番茄枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.lyscopersici)、棉花枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.vasinfectum)等进行多态性分析。随机引物S2扩增香蕉枯萎病菌1号小种得到一条特异想DNA条带,特异性DNA片段大小分别为700bp。根据特异性DNA片段的序列设计出针对1号的特异性引物TQ-R/F。用这对引物粉扩增出香蕉枯萎病菌1号小种的DNA特异性片段,将RAPD分子标记转化大小为400bp的SCAR标记。通过回检,结果表明,检测特异性、稳定性和灵敏型较好。该方法能够检测到相当于1ng的新鲜菌丝。用所建立的鉴定体系,能从广东省各地区的显症香蕉样品中检测到香蕉枯萎病菌1号小种。
3、通过对广东省和云南省10个地区的香蕉枯萎病菌4号小种菌株生物学特性方面的研究发现,产孢量越大,孢子萌发率越高,接种的香蕉苗发病时间越短,云南两地菌株相对广东地区菌株产孢量较大,蕉苗发病时间较短。广东各地区香蕉枯萎病菌在pH值为5-7时,菌丝生长较好;云南两地香蕉枯萎病菌病菌在pH值为8-9时,菌丝生长较好,酸碱土质可能是造成两省菌株差异的主要原因。
4、通过ITS序列比对,10个香蕉枯萎病菌4号生理小种中,云南的2个菌株与广东的8个菌株的rDNA-ITS区段序列存在着一定的差异,但各省不同地区菌株差异不大,两省菌株同源性极高,仅存在0.2％的差别,两省各地区菌株遗传距离仅差距0.002,说明香蕉枯萎病菌4号小种内存在着不同的分化类型,但分化程度并不是很大。