沼气是极具应用前景的清洁能源。发展沼气是解决农村能源供应问题和环保问题,建立循环农业体系、实现农业可持续发展和促进社会主义新农村建设的有效途径。高效稳定的微生物生态系统是沼气池稳定运行的关键。北方地区冬季寒冷,大多数沼气池存在产气少和利用效率低等问题,亟待解决。本研究以青海高寒地区农用沼气池为样本,运用Illumina MiSeq高通量测序结合PCR-DGGE技术研究了不同温度条件下微生物群落的变化特征,揭示温度对沼气发酵系统中微生物群落结构的影响;并采用宏基因组测序技术分析了不同温度条件下微生物群落的基因功能与代谢通路,探求代谢过程中沼气微生物贡献的关键酶及其功能。为发掘和研究具有特定功能的微生物类群奠定基础,也为改进青海沼气发酵工艺和提高利用效率提供理论依据和技术支撑。取得主要研究结果如下:1.采用PCR-DGGE技术研究了青海省不同地区(大通、湟源和乐都)农用沼气池发酵微生物群落结构。结果表明:15个沼气池含有丰富的细菌和古菌类群。细菌分属于10门、38 属,优势门为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria),最优势属为海洋滑动菌科Mangroviflexus属(Mangroviflexus);古菌分属于6目、10属,最优势类群为甲烷微菌目(Methanomicrobiales)的产甲烷菌属(Methanogenium)。无论细菌还是古菌,地区间的群落结构均存在明显差异。来自大通和湟源地区样品的群落结构较为接近,乐都地区与它们差异较大,说明青海农用沼气发酵系统中微生物的群落结构并不是单一模式。RDA双序图显示,发酵温度和海拔高度对微生物群落组成和多样性影响最大。发酵温度是最主要的影响因子,对海洋滑动菌科未分类属(Unclassified Marinilabiliaceae)、牛瘤胃菌属(Proteiniclasticum)、梭菌目未定科未分类属(Unclassified Clostridiales)、产甲烷菌属和热裸单胞菌属(Thermogymnomonas)影响显著。2.对青海农用沼气池全年内外温度及沼气产气量统计分析后发现,发酵温度受环境温度影响较大,出现特殊的“极值延后”现象;且温度越高,沼气产量越大。采用Illumina MiSeq通量测序结合PCR-DGGB技术研究了不同温度条件下青海农用沼气池发酵微生物群落的变化特征。结果表明,两种方法得到的沼气微生物多样性整体趋势一致,但是基于高通量测序得到的香农性-维纳指数(H’)显著高于DGGE,反映出前者的灵敏度更高。3.Hlumina Miseq高通量分析显示,青海乐都地区全年沼气池样品中共得到651037条细菌和29248条古菌的有效序列;共获得191286个细菌分类的OTUs和5207个古菌OTUs。细菌种类分属21门、345属;古菌分属6目、17属。厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门是最重要的功能细菌类群。互养菌门(Synergistetes)丰度受温度变化影响较大,与沼气产气的变化规律一致,可能是一类重要功能类群。在属分类水平,嗜蛋白菌属(Proteiniphilum)、梭菌属(Clostridium sensu stricto 1)、理研菌科佩特里单胞菌属(Petrimonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)和梭菌科Fastidiosipila属(Fastidiosipila)这5类菌群是所有样品中的优势类群,在沼气发酵中起重要作用。古菌类群中,甲烷微菌目和甲烷杆菌目(Methanobacteriales)构成了主要类群(其中,甲烷微菌目最优势)。在属水平上,产甲烷菌属是所有样品的最优势类群,其丰度随温度变化而变化,与沼气产气的规律一致,是产气的最主要功能类群。热裸单胞菌属受温度影响很大,其存在和含量可能在一定程度上反映出沼气系统中甲烷的产生效率。4.宏基因组测序LD-G2、LD-B2、LD-G5和LD-B5沼气污泥样品,分别得到约6.38Gb、5.80Gb、4.68Gb 和 5.36Gb 的有效序列;分别共获得 199467、184181、145803 和 142638 个 ORFs。KEGG分析温度变化与微生物群落碳代谢关系时发现,4个样品的糖酵解、磷酸戊糖和脂肪酸这几种基本代谢途径的功能基因完整存在,但对关键酶基因的贡献均为LD-G2>LD-B2>LD-G5>LD-B5。说明温度越高,微生物降解碳素的能力越强。同时,4个样品的尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(UDP,细菌合成胞外聚合物的关键酶)基因丰度随温度升高而增加。表明温度升高细菌产胞外聚合物的能力更强,更有利于降解各种碳源。5.KEGG分析了温度变化与微生物群落氮和硫代谢的关系,结果表明,各样品氨基酸代谢和参与硫酸盐还原过程所需的酶基因种类完整。4个样品中,谷氨酸脱羧酶和天冬氨酸-β-脱羧酶等氨基酸羧脱酶及硫代谢的酶类(ATP硫酸化酶、腺苷酰硫酸激酶、磷酸腺苷酰硫酸还原酶和亚硫酸还原酶)基因的丰度均为LD-G2>LD-B2>LD-G5>LD-B5;说明温度越高,微生物群落对氨基酸的分解代谢以及硫代谢反应速率越快。脲酶是尿素代谢的重要酶,温度对其至关重要。反硝化是无机氮代谢最主要的脱氮过程,温度越高,其效果越好。KEGG分析温度变化与微生物群落甲烷代谢的关系时发现,4个样品中产甲烷菌对甲基辅酶M还原酶(Mcr,甲烷代谢中的关键功能酶)基因贡献的丰度与温度成正比;氢营养型产甲烷菌参与的还原CO2途径所有通路完整,且对四氢甲烷蝶呤甲酰转移酶、甲酰四氢甲烷蝶呤环化水解酶、甲酰四氢甲烷蝶呤脱氢酶、甲酰四氢甲烷蝶呤还原酶等重要酶基因丰度的贡献同Mcr一样。说明温度越高,产甲烷菌还原CO2产生CH4的能力越强。由于4个样品中均不存在一氧化碳脱氢酶/乙酰CoA合成酶复合体(Codh/Acs)基因,故不存在乙酸营养型产甲烷菌参与的甲烷代谢途径。研究表明氢营养型产甲烷菌参与的还原CO2途径是青海农用沼气发酵系统中甲烷产生的主要途径。青海乃至北方寒冷地区鲜有农用沼气池发酵微生物群落结构与功能研究的报道。本研究发现了特殊的“极值延后”现象,有助于通过调控发酵温度来提高沼气产气量。研究采用分子生物学技术深入研究了青海高寒条件下农用沼气池发酵微生物的群落结构特征,解析了不同温度条件下微生物群落特异基因的功能活性和代谢过程,为构建适宜高寒地区的沼气微生物功能菌剂奠定了基础。