实验目的:本论文旨在对土家族药刺老苞根皮中皂苷类化学成分进行系统分离纯化和鉴定,得到刺老苞根皮皂苷类单体化合物,并对分离的单体化合物进行活性筛选,研究刺老苞根皮皂苷类化学成分对原代破骨细胞的抑制作用,一定程度上揭示刺老苞根皮治疗骨质疏松症的物质基础。实验内容:1.刺老苞根皮化学成分的研究依据皂苷类成分提取分离常规方法,利用现代分离与分析手段,纯化并鉴定刺老苞根皮的皂苷类化学成分,得到单体化合物。2.刺老苞根皮化学成分对原代破骨细胞的抑制作用体外培养原代破骨细胞并鉴定,以培养的原代破骨细胞为载体,对分离得到的单体化合物进行活性筛选,探索其对原代破骨细胞的影响。实验方法:1.刺老苞皂苷类成分的研究以70%乙醇为溶剂,加热回流法提取,浓缩得到浸膏。用大孔吸附树脂进行初步分离,乙醇梯度洗脱,依据薄层色谱合并浓缩。对30%～70%乙醇洗脱部分进行分离,以二氯甲烷-甲醇-水为流动相进行硅胶柱分离,以乙腈-水(0.01%的甲酸)为流动相进行液相制备,得到单体化合物。通过高分辨质谱及核磁共振波谱鉴定分子式及结构。2.刺老苞根皮化学成分对原代破骨细胞的抑制作用体外培养原代破骨细胞,利用抗酒石酸酸性磷酸酶阳性染色及骨吸收甲苯胺蓝染色进行鉴定。用CCK-8细胞毒性检测法检测单体对破骨细胞前体细胞活性的影响,排除高浓度抑制细胞的假阳性结果,筛选抑制破骨细胞的浓度范围,再利用TRAP阳性细胞数实验检测单体对破骨细胞的抑制作用。实验结果:1.刺老苞皂苷类成分的研究分离得到18个化合物,鉴定了其中11个化合物,其中齐墩果酸型皂苷9个,包括:TarasaponinⅣ(化合物 Ⅰ)、Stipuleanoside R2(化合物 Ⅱ)、Araloside C(化合物 Ⅲ)、Decaisneanaside(化合物 VⅥ)、Chikuselsusaponin Ⅴ(化合物Ⅶ)、Araloside A(化合物 Ⅷ)、Chikuselsusaponin ⅣVa(化合物 Ⅸ)、Narcissiflorine(化合物 Ⅻ)、Ealenduloside(化合物 ⅩⅢ)。得到 2 个新化合物化合物V和化合物Ⅳ,该类化合物的苷元是新骨架苷元。2.刺老苞根皮化学成分对原代破骨细胞的抑制作用在0～50 μg/mL浓度范围可排除单体化合物对破骨细胞抑制的假阳性结果。Stipuleanoside R2、Araloside C、Araloside A、Chikuselsusaponin ⅣVa 的 IC50分别为:81.217± 1.910、478.012±2.679、71.207± 1.853、5.286±0.723 μg/mL。Stipuleanoside R2、Araloside C、Araloside A、Chikuselsusaponin Ⅳa 的低、中、高浓度(0.5、5、50 μg/mL)与对照组相比,破骨细胞数目均有所减少,呈现一定的抑制效果,数据有统计学差异意义(P<0.05或P<0.01)。其中,Stipuleanoside R2各浓度破骨细胞数目减少,抑制作用较为明显;Araloside C、Araloside A破骨细胞数目可随着浓度递增而呈下降变化;ChikuselsusaponinⅣa各浓度组破骨细胞数目有所减少,但随浓度递增的变化不明显。通过 Araloside C、Araloside A 及 Chikuselsusaponin Ⅳa 实验结果对比,当糖的数量不同时,化合物对原代破骨细胞的抑制作用有差异,但差异并不明显;通过Stipuleanoside R2及Araloside C实验结果对比,当糖的数量及连接位置相同时,糖的种类不同,化合物对原代破骨细胞的抑制作用也有差异,差异较为明显。根据以上,初步推测该类化合物的苷元相同时,侧链上糖种类对原代破骨细胞增殖的影响比糖数量的影响大。实验结论:1.刺老苞根皮中的皂苷类成分以齐墩果酸型三萜皂苷为主,并含有新型皂苷类成分化合物Ⅴ和化合物Ⅳ,该类化合物的苷元是新骨架苷元。2.刺老苞根皮提取的齐墩果酸型皂苷Stipuleanoside R2、Araloside C、Araloside A、Chikuselsusaponin ⅣVa在0～50 μg/mL浓度范围能抑制原代破骨细胞的增殖。该类化合物的苷元相同时,侧链上糖种类对原代破骨细胞增殖的影响比糖数量的影响大。