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钩虫(hoookworm)是钩口科线虫的统称,是重要的人兽共患寄生虫。成虫寄生于肠道吸食血液,破坏粘膜,严重寄生会造成严重贫血,是世界范围内缺铁性贫血的主因,儿童感染钩虫后会造成发育迟缓。 为了解犬钩虫中DAF-12、DAF-19、DAF-21,mex-3的功能,我们对犬钩虫的daf_12B、daf-19,daf-21基因进行了克隆并和mex-3基因一起进行表达鉴定。获得的cDNA片段大小分别为571bp(daf-12B)、570bp(daf-19)、468bp(daf-21)。将测序正确的片段构建到原核表达载体上,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析表达情况。 分析发现重组蛋白分子量大小分别为36kDa(DAF-12B)、40kDa(DAF-19)、38kDa(DAF-21)和48kDa(MEX-3),进行了重组蛋白的纯化和免疫获得相应抗体。用Western Blot检测了这些蛋白在L1/L2、L3、雌虫中的表达情况,结果表明这些蛋白在L1/L2、L3和雌虫中均有表达。 Real-time PCR的结果显示daf-12B的mRNA转录发生在犬钩虫的L1/L2、L3、雌虫和雄虫阶段,在成虫阶段表达较高,其中雄虫表达量最高;daf-19的mRNA在L3期表达量最高;daf-21的mRNA转录在成虫阶段表达量非常之高,L3期幼虫中含量很少,在L1/L2期幼虫中表达量最低。用RT-PCR技术检测mex-3的mRNA在犬钩虫不同阶段的转录情况,在L2期中几乎未表达,L3期含量也较低,而在成虫特别是雌虫中含量很高。 利用免疫荧光抗体染色分析了这四种蛋白在犬钩虫不同发育时期的表达情况,发现这四种基因在犬钩虫不同发育时期均有表达。DAF-12B在犬钩虫L1/L2期中幼虫头部,特别是食道球中的荧光强烈,L3期DAF-12B分布在整个虫体中,成虫切片免疫荧光定位结果显示DAF-12B分布在皮层、卵巢等部位。 DAF-19在虫卵细胞质中有明显的表达,在L1/L2期肠道处荧光特别强烈,L3期可以观察到DAF-19在食道腺、肠道细胞胞质荧光较亮,尾部有特异性荧光表达。DAF-19在钩虫体腔壁、肠壁有特异性的分布,在卵巢、卵壁以及卵内都有分布。 DAF-21在虫卵中有明显表达。在L1/L2期,我们发现表皮处荧光特别强烈,L3期可以观察到DAF-21分布在虫体前部食道腺、肠道。DAF-21在钩虫体腔壁、肠壁有特异性的分布。 MEX-3在虫卵细胞质中有明显的表达,荧光强烈.在L1/L2期,我们发现钩虫幼虫的食道球前、肠道处荧光特别强烈,L3期可以观察到MEX-3分布在虫体前中部和尾端,在肠道中荧光十分强烈。MEX-3在钩虫体腔壁外层有特异性的分布,在卵壁以及卵内都有分布。