肥胖症是指人体进食的热量多于消耗热量时,多余的热量以脂肪形式储存在体内,导致体内脂肪堆积过多和(或)分布异常,进而导致体重增加的一种多因素慢性代谢疾病。众所周知,肥胖对人体健康危害极大。肥胖是糖尿病、高血压、高脂血症、高胰岛素血症、冠心病、胆石症、痛风症、癌症等多种疾病的危险因素,肥胖者并发糖尿病较为多见,40岁以上的糖尿病病人70-80%病前有肥胖史。30-50%的肥胖者合并有高血压,20-30岁的肥胖人群中,高血压的发病率是体重正常者的2倍。中年男性肥胖者冠心病的发病率是体重正常者的2倍。近年来研究还发现,鼾症患者多见于肥胖者。肥胖者的鼻腔纵隔周围大量脂肪堆积,妨碍正常呼吸时的气体交换,表现为鼾症。因此,预防和控制肥胖症的发生和发展意义重大。肥胖症常用体重指数(body mass index, BMI)来判断,BMI值等于体重(以公斤为单位)除以身高(以米为单位)的平方。世界卫生组织规定BMI≥25为超重,BMI≥30为肥胖。肥胖症的病因学研究发现,导致肥胖发生的主要因素包括遗传因素、环境因素及个人行为因素。但是肥胖对健康危害的核心环节是脂肪细胞积聚过多,脂肪细胞的过度分化与体积的增大,生成了过多功能失调的脂肪细胞。因此,也有学者定义肥胖症是指体内脂肪细胞数目增多或体积增大,脂肪(主要是甘油三酯)堆积过多,使体重超过标准体重的20%以上的病理状态。可见,脂肪细胞生长、分化及功能的分子调控机制是研究肥胖发病机制的重要环节。转录因子Twist1基因是1987年在果蝇中发现的一个新基因,属于碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)转录因子家族。大量研究证实,Twist1基因广泛参与多种组织的形成,如：骨、肌肉、神经、心脏、造血组织及脂肪组织等。Twist1在脂肪组织功能的研究是近年来的研究热点。有学者发现在人类白色脂肪组织和棕色脂肪组织中Twist1基因呈高表达。也有学者证实,Twist1表达水平影响机体发生肥胖的敏感性。已有的研究提示,转录因子Twist1与肥胖症的发生和发展关系密切,但是关于Twist1在肥胖症发生和发展过程中的具体作用环节及分子调控机制尚需大量工作去探索。因此,进一步深入探讨转录因子Twist1对脂肪细胞分化过程的影响、Twist1调控肥胖症发生发展的中间环节及分子调控机制对于临床预防和控制肥胖症意义重大。实验工作分以下两部分开展：第一部分转录因子Twist1在肥胖小鼠、大鼠及人个体脂肪组织中的表达研究目的：探讨转录因子Twist1在高脂饮食诱导下的肥胖C57/BL6J小鼠和Wistar大鼠模型皮下脂肪组织和内脏脂肪组织中,及在患有肥胖症的临床个体脂肪组织中的表达变化,以明确Twist1与肥胖症的关联。研究内容：1、高脂饮食诱导肥胖C57/BL6J小鼠动物模型的建立：以C57/BL6J小鼠(6周龄,雄性,24只)为研究对象,适应性饲养一周后,将小鼠随机分为两组,12只／组,6只／笼。饲养环境为昼夜12小时交替,室温22-26℃,相对湿度45-60%。两组分别喂食不同的饲料,其中实验对照组喂食啮齿动物基础饲料(脂肪含量5%),肥胖模型组喂食高脂饲料(脂肪含量20%)。实验期间小鼠自由摄食及饮水,每周称量动物体重一次。肥胖模型组动物体重比实验对照组增加20%以上视为C57/BL6J小鼠肥胖症模型造模成功。2、高脂饮食诱导肥胖Wistar大鼠动物模型的建立：以Wistar大鼠(3月龄,雄性,24只)为研究对象,适应性饲养一周后,将大鼠随机分为两组,12只/组,4只/笼。饲养环境为昼夜12小时交替,室温22-26℃,相对湿度45-60%。两组分别喂食不同的饲料,其中实验对照组喂食啮齿动物基础饲料(脂肪含量5%),肥胖模型组喂食高脂饲料(脂肪含量20%)。实验期间大鼠自由摄食及饮水,每周称量动物体重一次。肥胖模型组动物体重比实验对照组体重增加20%以上视为Wistar大鼠肥胖症模型造模成功。3、模型制备成功后的血清学检测：模型制备成功后,C57/BL6J小鼠和Wistar大鼠均经深度麻醉,并进行血液采集。其中C57/BL6J小鼠采取眼球取血,Wistar大鼠取股动脉血,离心获取血清,检测血清中总胆固醇(cholesterol, CHOL)、甘油三酯(triglycerides, TG)、及血糖(glucose,GLU)的含量。4、模型制备成功后检测Twist1基因在脂肪组织中的表达差异：造模成功后,均深度麻醉下分别取C57/BL6J小鼠和Wistar大鼠的皮下和内脏脂肪组织(主要是肾周脂肪组织),分别提取脂肪组织的RNA和蛋白质,进行RT-PCR和Western Blot检测,分析Twist1在不同肥胖体征动物的皮下和内脏脂肪组织中的表达变化。5、临床不同肥胖体征患者脂肪组织的收集：收集2012年9月至2013年12月在山东大学附属千佛山医院整形外科进行抽脂或脂肪移植手术的成年患者90例,男女不限,所有纳入选择的患者均无肥胖家族史。术前均获得患者的知情同意,且本课题的开展得到山东大学医学伦理学委员会的批准。所有纳入选择的患者按照其BMI值分为四组：BMI≤20组(偏瘦组,15例)、20<BMI<25组(正常组,26例)、25≤BMI<30组(超重组,21例)BMI≥30组(肥胖组,28例)。术中收集患者的脂肪组织,-80℃冰箱中保存备用。6、临床肥胖个体脂肪组织中Twist1的转录和蛋白表达水平检测：对脂肪组织进行脂质抽提后,分别提取其RNA和蛋白质,进行RT-PCR和Western Blot检测,分析Twist1在不同肥胖体征患者脂肪组织中的转录和蛋白表达水平变化。研究结果：1、高脂饮食诱导肥胖模型组小鼠的体重显著升高：实验开始前,基础对照组小鼠体重为(19.71±1.08)g,与肥胖模型组(19.90±1.02g)比较差异无统计学意义(P>0.05)。至模型制备第14周时,肥胖模型组小鼠体重为(34.86±2.98)g,显著高于基础饲料饲养的对照组(26.154±2.95)g,差异具有统计学意义(P<0.05),两组间体重差值为33.31%。2、高脂饮食诱导下肥胖模型组小鼠血清学指标的检测：至肥胖模型制备成功时,我们检测了小鼠动物血清中CHOL、GLU和TG的含量,与对照组相比较,模型组小鼠血清中CHOL和GLU显著升高(P<0.05),但是TG的含量两组间没有统计学差异(P>0.05)。3、高脂饮食诱导肥胖Wistar大鼠体重显著升高：至饲养第14周时,基础对照组和肥胖模型组Wistar大鼠的体重分别为(342.66±31.46)g和(438.61±37.65)g,两组间体重差值为28.0%,差异显著(P<0.05)4、高脂饮食诱导肥胖Wistar大鼠血清学指标的检测：至肥胖模型制备成功时,与基础对照组相比较,模型组Wistar大鼠血清中CHOL和GLU含量显著升高(P<0.05),但是TG的含量两组间没有统计学差异(P>0.05)。5、肥胖C57/BL6J小鼠和Wistar大鼠脂肪组织中Twist1的转录水平显著下调：以对照组动物的皮下和内脏脂肪中Twist1的相对转录水平为100%,肥胖C57/BL6J小鼠和肥胖Wistar大鼠的皮下和内脏脂肪组织中Twist1的转录水平均显著下调,半定量结果显示下调程度均具有统计学差异(均P<0.05)。6、肥胖C57/BL6J小鼠和Wistar大鼠脂肪组织中Twist1的蛋白水平显著下调：以对照组动物的皮下和内脏脂肪中Twist1的蛋白表达水平为100%,肥胖C57/BL6J小鼠和肥胖Wistar大鼠的皮下和内脏脂肪组织中Twist1的蛋白水平也均显著下调,半定量结果显示下调程度也均具有统计学差异(均P<0.05)。7、临床肥胖患者脂肪组织中Twist1的转录和蛋白表达水平均显著下调：以正常体重组(20<BMI<25)中Twist1的转录和蛋白表达水平均为100%,偏瘦组(BMI<20),超重组(25≤BMI<30)和肥胖组(BMI≥30)中Twist1的转录水平分别为(111.43±15.43)%,(89.97±12.54)%和(42.66±6.28)%；Twist1的蛋白表达水平分别为(130.31±15.82)%,(80.39±10.34)%和(25.43±2.48)%。其中肥胖组(BMI>30)中Twist1的转录和蛋白表达水平与正常组比较均有统计学差异(均P<0.05)。研究结论：通过动物模型实验和临床标本检测实验,证实在肥胖症的发生过程中Twist1在皮下脂肪组织和内脏脂肪组织中的表达均显著下调,即Twist1的表达与肥胖症的发生负相关,Twist1有望成为肥胖症发生的新标志基因。第二部分转录因子Twist1对脂肪前体细胞3T3-L1体外诱导分化的影响及其在肥胖症发生中的作用机制分析研究目的：探讨转录因子Twist1的表达在脂肪前体细胞3T3-L1体外分化为成熟脂肪细胞过程中的动态变化,分析Twist1的表达变化对3T3-L1诱导分化的影响,并进一步分析Twist1影响肥胖症的分子生物学机制。研究内容：1、脂肪前体细胞3T3-L1体外诱导分化体系的建立和鉴定：体外培养小鼠脂肪前体细胞3T3-L1,胰岛素、地塞米松和3-异丁基-1-甲基-黄嘌吟(3-Isobuty-1-methylxanthine, IBMX)的联合作用下诱导分化为成熟脂肪细胞,借助油红O染色法鉴定脂滴的形成,并经异丙醇萃取后于紫外分光光度计下检测油红O在510nm处的吸光度值。收集脂肪前体细胞3T3-L1诱导分化过程中(诱导分化第0天、2天、4天、8天和12天)的脂肪细胞,分别提取RNA及蛋白质,检测脂肪细胞分化的标志分子过氧化物酶体增殖因子活化受体y (peroxisome proliferator-activated receptor y, PPARγ)、脂肪细胞脂类结合蛋白(adipocyte lipid binding protein, ALBP)在诱导分化过程中的表达变化。2. Twist1在脂肪前体细胞3T3-L1诱导分化过程中的动态表达变化：以收集的诱导分化第0天、2天、4天、8天和12天的脂肪细胞RNA及蛋白质为材料,检测在脂肪细胞分化成熟过程中Twist1mRNA及蛋白质表达水平的变化。3、靶向干扰Twist1的慢病毒载体的构建及病毒包装：构建靶向Twist1shRNA的慢病毒载体,293FT细胞包装病毒颗粒,感染3T3-L1脂肪前体细胞,筛选出稳定干扰Twist1蛋白表达的3T3-L1单细胞克隆。4、干扰Twist1表达对脂肪前体细胞3T3-L1体外诱导分化的影响：以感染了空白对照病毒颗粒的脂肪前体细胞3T3-L1为对照(3T3-L1/NC),分析干扰Twist1表达对脂肪细胞3T3-Ll诱导分化的影响。具体检测油红0染色的组间差异及PPARγ在组间诱导分化不同时间点的表达差异。5、干扰Twist1表达对3T3-L1诱导分化过程中PPARγ表达的影响：以感染了空白对照病毒颗粒的脂肪前体细胞3T3-L1为对照(3T3-L1/NC),以同一诱导分化时间点下组间的PPAR γ表达差异为研究对象,分析干扰Twist1表达对同一诱导分化时间点下对照组和干扰组PPAR γ表达的影响。6、干扰Twist1表达对3T3-L1诱导分化过程中脂肪细胞因子分泌水平的影响：借助于RayBiotech公司的小鼠抗体分析阵列I芯片,以感染了空白对照病毒颗粒的脂肪前体细胞3T3-L1为对照(3T3-L1/NC),检测干扰Twist1表达对3T3-L1分泌的脂肪细胞因子的影响。研究结果：1、成功建立脂肪前体细胞3T3-L1的体外诱导分化体系：在诱导分化过程中首先可见成纤维样的脂肪前体细胞逐渐变成圆形,且细胞内开始形成小的脂滴,脂滴呈戒环样分布在细胞浆,随着分化时间的延长,脂肪细胞内充满肉眼即可明显辨识的脂滴,且很多小脂滴融合形成大脂滴。诱导分化第12天可见细胞内充满大量脂滴。2、油红O染色证实脂肪细胞内脂滴含量逐渐增加：油红0能够与甘油三酯结合呈小脂滴状,借助这一原理,我们用油红0染色法鉴定了细胞内脂滴的存在,并用紫外分光光度法定量检测了细胞内脂滴的含量。未作诱导分化处理的对照组细胞油红O染色不着色,而诱导分化组细胞油红O染色着色明显,呈鲜亮的橘红色,且随着分化程度的加强,油红O染色着色更加明显。定量结果提示自诱导分化第四天起,油红0染色着色强度就显著高于对照组细胞。3、脂肪细胞分化标志分子PPARγ和ALBP表达显著上调：在脂肪前体细胞内表达极微量的脂肪细胞分化标志分子PPARγ和ALBP,随着诱导分化时间的延长,PPARγ和ALBP的表达均显著上调,与未作诱导分化处理的对照细胞相比较,自诱导分化第4天起,PPARy和ALBP的表达具有统计学差异(P<0.05)。4、脂肪分化过程中转录因子Twist1的转录和蛋白表达水平均升高显著：在脂肪前体细胞3T3-L1诱导分化过程中,转录因子Twist1的转录和蛋白表达水平均呈时间依赖性上升,与未作诱导分化处理的对照细胞相比较,自诱导分化第4天起,Twist1的转录和蛋白表达水平均升高显著(P<0.05)。5、干扰Twist1表达不影响3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化的进程：我们构建的慢病毒载体LV3/Twist1shRNA能够有效干扰Twist1的表达至20-30%。以筛选出的靶向干扰Twist1表达的3T3-L1脂肪前体细胞单克隆为材料,与阴性对照细胞对比,发现干扰Twist1表达对脂肪细胞内油红O的染色没有显著影响,对脂肪细胞分化标志分子PPARy在两组间的表达也没有显著影响,提示干扰Twist1表达对3T3-L1脂肪前体细胞的体外诱导分化进程没有显著影响(P>0.05)6、干扰Twist1表达显著上调诱导分化第4天时PPARy的表达：通过对阴性对照细胞3T3-L1/LV3和有效干扰细胞3T3-L1/Twist1-的同一诱导分化时间点下PPARy的转录和蛋白表达检测,我们发现在诱导分化第4天,干扰Twist1表达的3T3-L1/Twist1-细胞中PPARy的转录和蛋白表达水平均显著高于同一时间点下的阴性对照细胞3T3-L1/LV3(P＜0.05)7、干扰Twist1表达影响部分脂肪细胞因子的分泌：借助细胞因子的微阵列芯片检测技术,我们发现干扰Twist1表达能够促进或抑制部分脂肪细胞因子的分泌。这些细胞因子的种类主要集中在白介素类及其受体(含IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-17, IL-21,和IL-27)、生长因子及其受体类(含FGF,GHR, HGF, VEGF, TNF)和趋化因子家族(含CXCR4, CCR6, MCP-1)等。研究结论：通过本部分实验的实施我们发现：(1)在脂肪细胞诱导分化过程中Twist1表达显著上调,但是干扰Twist1表达不影响3T3-L1脂肪前体细胞体外诱导分化的进程；(2)众所周知,PPARy在脂肪细胞的多种生理功能中发挥着重要调节作用,我们发现干预脂肪前体细胞3T3-L1中的Twist1表达水平能够显著影响诱导分化第4天时PPARy的表达,这为阐明Twist1影响肥胖症发生发展的分子机制提供了重要线索；(3)近年来研究发现,脂肪组织还是一个重要的内分泌器官,具有复杂的内分泌及代谢作用,功能十分活跃。我们发现干预脂肪前体细胞3T3-L1中的Twist1表达水平能够显著影响脂肪细胞3T3-L1分泌的多种细胞因子,含白介素类及其受体(含IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-17, IL-21,和IL-27)、生长因子及其受体类(含FGF,GHR,HGF,VEGF,TNF)、趋化因子家族(CXCR4, Cys-Cys receptor6(CCR6), monocyte chemotactic protein-1(MCP-1))等,这也为阐明Twist1影响肥胖症发生发展的分子机制提供了重要价值。综合以上,我们认为转录因子Twist1与肥胖症的发生和发展关系密切,但是Twist1影响肥胖症发生发展的分子机制不在于调控脂肪细胞的分化过程,而可能在PPARy或脂肪细胞因子参与调控的脂肪细胞的另外一个或多个生理功能中。