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石油危机和高分子材料难降解等问题突显,环境友好型高分子材料的开发与应用引起了极大的关注。生物絮凝剂因其无毒、能自然降解等特性在水处理领域倍受青睐。目前已经筛选并鉴定的生物絮凝剂产生菌株众多,但其代谢途径和相关分子水平的研究还鲜有报道。
本研究从多糖絮凝剂产生菌地衣芽孢杆菌CGMCC2876出发,改变其培养条件,合成出形态和性质都异于多糖的生物絮凝剂,通过紫外光谱、红外光谱、质谱、高效液相色谱以及核磁分析,鉴定出该生物絮凝剂由94.43%γ-聚谷氨酸(γ-PGA)、3.92%多糖和1.65%蛋白质组成。
首先,对实验菌株发酵条件进行优化,确定其最佳培养基组成(gL-1):柠檬酸三钠20,甘油20,NH4Cl9,谷氨酸钠10,MgSO4·7H2O0.5,K2HPO40.5,pH7.2;最佳培养条件:200 rpm,37℃摇瓶培养20 h。此时,絮凝活性达到11670U mL-1,产量为21.8 gL-1。同时,该生物絮凝剂具有良好的pH和热稳定性,与常用的化学絮凝剂聚丙烯酰胺相比,在制糖工业澄清工段中脱色效果相当,除浊能力更强。
其次,考察培养基成分对实验菌株合成的γ-PGA分子结构的影响,结果表明:实验菌株为兼性谷氨酸依赖型,当不添加谷氨酸钠时,γ-PGA由62.22%D-谷氨酸(D-Glu)单体组成,反之,由37.09%D-Glu组成;γ-PGA的分子量主要有三种:2.0×106 Da、6.0×105 Da和2.0×105 Da,三者含量与柠檬酸三钠的浓度有关。同时,γ-PGA的产量、D-Glu的含量及2.0×105 Da含量与其絮凝活性呈正相关性,6.0×105 Da和L-Glu的含量则呈反相关性。
随后,克隆了实验菌株中γ-PGA合成酶基因—pgsBCA,该基因由3个开放阅读框架组成,大小为2974bp,与B.licheniformis WBL-3中pgsBCA基因的相似度为98%。在E.coli JM109细胞外不仅可以合成γ-PGA而且有较高的絮凝活性。利用数据库对γ-PGA合成酶复合物(PgsBCA)进行定位并分析其3-D结构、生化性质和功能,探索其相互作用机制:PgsB参与γ-PGA的延伸,PgsA可被Mg2+激活将γ-PGA从结合位点脱离,与PgsC将产物运输到胞外。
同时,对课题组筛选获得的阳性多糖絮凝剂克隆子的插入片段进行注释,大小为29.6 kb,由26个开放阅读框架组成,分析其所编蛋白质的生化性质、功能及参与的代谢途径。确定了实验菌株合成多糖絮凝剂的关键基因:糖基磷酸转移酶基因(bli2)、糖基转移酶基因(bli16)、ABC转运蛋白基因(bli9、bli10和bli11和多糖絮凝剂降解的基因(bli1),以及两个基因簇(bli7~11和bli16~18),并构建了实验菌株合成多糖絮凝剂的代谢途径。
最后,采用基因敲除的方法,考察了pgsBCA基因对实验菌株合成生物絮凝剂的影响。利用重叠PCR技术成功构建pgsBCA基因敲除质粒并导入实验菌株中,但pgsBCA基因缺失菌株的筛选还在进行。为实验菌株合成多糖絮凝剂和γ-PGA絮凝剂的合成代谢途径及相关性的研究奠定基础。