酯酶具有催化酯化、转酯、光学活性物质动力学拆分以及酯交换的作用,在工业酶催化领域中有着广泛的应用。但是很大一部分工业化应用的酯酶来自于嗜温微生物,在诸如高温、有机试剂存在的工业环境中不稳定甚至丧失活性,来自真细菌的嗜逆性显著的酯酶的报道很少。嗜热酯酶在有机溶剂耐受性、耐热性以及催化速率等方面拥有独特的优势,是近年来生物催化领域的研究热点。本文从NCBI上得到热纤梭菌(JCM9323)酯酶基因dsm序列,以其基因组为模板,PCR获得该基因,构建重组载体pET-28a-dsm;将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导并利用SDS-PAGE电泳进行目的蛋白(37 kDa)的可溶性表达分析,发现目的蛋白主要以包涵体形式表达;经Ni-NTA亲和层析纯化获得目的蛋白,以尿素浓度梯度法复性目的蛋白,将复性后的蛋白免疫小白鼠,制备多克隆抗体,以western blotting的方法检测发现制备的抗体血清对目的蛋白有较好的特异性。对酯酶DSM进行酶学性质分析发现,其最适底物为对硝基苯丁酸酯(pNPB-C4),对于一些长链的脂肪酸也有一定的水解能力。酶的最适温度和pH分别为65℃和7.0;在65℃和70℃分别孵育3 h后,其残留活力仍能保持70%和60%,说明该酯酶具有很好的耐热性;Ca2+和Mg2+对该酶有一定的激活作用,而Cu2+、Ni2+则抑制该酶的活性;该酶在甲醇、DMSO存在的情况下仍能保持一定的活力,其他表面活性剂和有机试剂对该酯酶活性具有明显的抑制作用。此外,该酯酶需要在2.5 mM DTT存在的情况下才能表现出酯酶活力。酶固定化技术是提高酶工业化应用的重要手段,枯草杆菌的芽孢具有极好的抗逆性,是作为嗜热酶的理想的固定化载体,但近年来的研究报道很少。本文利用枯草杆菌芽孢表面展示系统展示了来自热纤梭菌的耐热酯酶并探究了展示后的酯酶的酶学性质。本研究利用芽孢衣壳蛋白CotB作为锚定蛋白来展示DSM酯酶。首先利用Overlap PCR构建CotB-dsm融合基因,然后构建pHS-CotB-dsm重组表达载体,将其转入芽孢杆菌DB403菌株中,并诱导重组芽孢的产生,利用western blotting技术和蛋白酶、抑制剂处理重组芽孢后酶活性的变化验证了DSM酯酶展示在芽孢表面,但是表达量较低。以pNPB-C4为底物研究展示后的酯酶的活性发现,最适温度和pH分别为60℃和7.5,温度和pH适应性范围相比游离酯酶获得比较大的提高;展示的酯酶在60℃和70℃分别孵育5 h后,其残留活性分别为78%和68%,70℃时残留活性是游离酶的两倍;在有机试剂和表面活性剂中,展示的酯酶的残留活性也远大于游离酶,而且具有良好的DMSO耐受性,即在20%DMSO溶液中孵育7 h,其残留活性仍能达到65%。在最适反应条件下(60℃,pH7.5),其比活力为3.0×10-9 U/spore。通过简单的离心回收重组芽孢重复利用3次后,其相对活力仍能保持在75%。芽孢表面展示酯酶后,本论文继续探究了不同连接肽对展示的酯酶活性的影响。结果显示:与不含连接肽相比,含连接肽的重组芽孢在最适温度下活性都有一定程度的提高;最适pH测定中,插入P2(PTPTPT)2和S2(EGKSSGSGSESKST)连接肽的重组芽孢的活性提高的比较大,在pH为9.6时,相对活性分别为70%和62%,是无连接肽的活性的1.75和1.5倍;在80℃的条件下,含有S3(GGGGS)4连接肽的重组芽孢耐热性最好,孵育5 h后残留活性仍达到55%,是无连接肽活性的1.2倍。在不同浓度DMSO(10%,20%)中,含有连接肽的重组芽孢的活性都有所提高,其中,20%浓度下,含S2连接肽的重组芽孢的相对活性是无连接肽的1.5倍。在不同浓度甲醇(10%,20%)中,S2连接肽能够明显提高展示酯酶的活性,20%浓度下,是无连接肽活性的2.2倍。本研究发现,来自真细菌热纤梭菌的酯酶DSM具有较好的热稳定性,并且能在一定程度上耐受有机试剂,对工业化应用有着一定的价值;通过枯草杆菌芽孢表面展示,其耐热性,耐有机溶剂性以及回收利用性相对游离酶都得到了很大的提升;通过融合蛋白技术,发现不同连接肽对展示的酯酶的活性和耐受性等性质的影响较大,进一步优化展示酯酶的连接肽,将有利于获得更高活性和抗逆性的重组芽孢。综上所述,经连接肽优化的枯草杆菌芽孢表面展示系统作为一种新的抗逆性酶固定化技术,在恶劣环境的工业生物催化中具有重要的应用潜力。