1966年在威斯康星洲的火鸡体内首次发现了H9N2亚型禽流感病毒,自20世纪90年代以来,该病毒广泛在亚洲国家的家禽中流行,不但给养禽业带来了巨大的损失,而且严重危害人类健康。为控制禽流感病毒的传播,禽流感疫苗被广泛的应用,然而有专家推测疫苗抗体选择压也会加速流感病毒的抗原变异,导致免疫失败,甚至引发新型禽流感的流行。本实验室前期以1998年分离株A/chicken/Shanghai/F/98 (H9N2, Ck/SH/F/98,简称F株)为研究对象,使Ck/SH/F/98株在有疫苗抗体压力的SPF鸡胚中连续传代,获得抗原显著变异的病毒mF50,序列分析显示其HA基因有4个氨基酸位点发生突变,分别是K131R, S145N、G181E和A198V。为研究疫苗抗体选择压导致抗原变异的分子机制,本论文用抗原变异病毒mF50免疫BALB/c小鼠,成功制备出16株针对mF50病毒血凝素蛋白的单克隆抗体；通过PCR和点突变,分别构建含有抗原变异病毒HA基因的4个氨基酸突变的真核表达载体;通过转染和ELISA方法,研究抗原变异病毒HA基因的氨基酸变异与抗原变异的关系,以分析引起抗原变异的关键氨基酸,为控制H9N2亚型禽流感病毒的流行提供更好的理论基础。1、抗原变异病毒mF50单克隆抗体的制备mF50病毒经10日龄SPF鸡胚增殖,3天后收集尿囊液,经差速离心后获得纯化的mF50病毒,将纯化的病毒作为免疫原,免疫8周龄的BALB/c雌性小鼠,加强免疫后取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。用纯化病毒包被板子,通过ELISA的方法对杂交瘤细胞进行初筛。阳性细胞进行三次亚克隆,筛选到的阳性杂交瘤细胞用BALB/c小鼠进行制腹水。经Western blot方法检测,获得16株针对mF50病毒血凝素蛋白的单克隆抗体,分别命名为4F1、3D6、6C6、2H6、4B11、4E9、1D5、3G1、5A4、3C5、4H8、6D1、3D5、 1D3、5B9、2C4。所获的单克隆抗体与母本病毒mF50的HI效价在26-29, ELISA效价在105-107,与H9亚型禽流感病毒具有的特异性血凝抑制(HI)反应,与H5亚型禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、产蛋下降综合症病毒、新城疫病毒无任何交叉反应。2、单克隆抗体在抗原变异上的初步应用本实验室前期分析抗原变异的传代病毒的序列发现,其HA基因上有4个氨基酸的突变,分别是K131R、S145N.G181E和A198V。为探讨HA的4个氨基酸突变在抗原变异中的作用,本论文通过Rr-PCR,基因克隆等分子生物学方法,分别构建了含有K131R、S145N.G181E和A198V单突变的HA(称为rFHA131、rFHA145、rFHA181、rFHA198)、含有K131R、S145N.G181E和A198V四个突变的HA(称为rFHA131-145-181-198)、含有K131R、G181和A198V三个突变的HA(称为rFHA131-181-198)、含有G181E和A198V两个突变的HA(称为rFHA181-198).含有S145N和G181E两个突变的HA(称为rFHA145-181)以及不含突变的F株的HA(称为rFHA)。将这些HA插入pCAGGS真核表达载体中；将以上质粒分别转染到293T细胞中以表达HA蛋白；然后以表达的HA蛋白为抗原,本论文获得的单克隆抗体为抗体,进行ELISA检测；以筛选针对HA突变的单克隆抗体,分析决定抗原变异的氨基酸位点。结果显示大部分单抗是针对除四个突变以外的其他抗原位点的,而单抗3G1与所有含有198V突变的HA蛋白都有强反应性,与其它突变及F株的HA蛋白不反应,证明单抗3G1可能是针对HA 198位的：同样,单抗5B9与所有含有181E突变的HA蛋白都有强反应性,与其它突变及F株的HA蛋白不反应,证明单抗5B9可能是针对HA181E位的,推测H9N2亚型禽流感病毒的HA基因中G181E和A198V位点的氨基酸替换在H9N2亚型禽流感病毒抗原变异中起重要作用。