阿尔茨海默病（AD）是一种涉及到老年人的不可逆转的神经退行性疾病,病理特征主要表现为皮层区和海马区出现由β淀粉蛋白（Aβ）堆积形成的老年斑（SP）及tau蛋白异常磷酸化形成的神经纤维缠结（NFTs）。AD的发病机制复杂且相互关联,存在各种假说试图解释其发病机制,如胆碱能障碍假说、Aβ蛋白级联假说、磷酸化tau蛋白假说、神经炎症假说、氧化应激假说、金属离子失衡假说等,其中针对SP的Aβ蛋白级联假说与NFTs的磷酸化tau蛋白假说是当前的主流学说。美国食品药品监督管理局（FDA）批准的临床上用于抗AD的药物有胆碱酯酶抑制剂（他克林、多奈哌齐、加兰他敏、利凡斯的明）和N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDA受体）拮抗剂美金刚,只能适度的减轻记忆和认知缺陷,不能逆转AD的进程。随着老龄化进程的加快,AD患者数量在逐年增多,现有的治疗药物已无法满足临床需要,开发有效的抗AD药物成为药学工作者亟待解决的问题。AD的发病机制复杂,各机制之间相互联系、相互影响,多种因素相互作用。因此,单一靶标、单一作用机制药物的作用有限,这可能是目前缺乏有效逆转AD进程药物的重要原因。因此,多靶向抗AD药物,特别是多作用机制、靶向AD多个环节的药物研发,成为抗AD药物研究的重要方向。糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,是联结Aβ、tau蛋白、炎症、突触与神经元等的关键分子,与AD形成的多个环节密切相关。GSK-3β激活能诱导tau蛋白异常磷酸化,削弱tau蛋白与微管的相互作用,导致tau蛋白从微管中分离。异常磷酸化的tau蛋白还能聚集形成NFTs,引起神经细胞死亡。GSK-3β能上调Aβ形成过程中关键酶BACE1的活性,促进Aβ产生,进而引发β淀粉蛋白的沉积,形成SP。另外,GSK-3β过度激活还能影响神经递质释放、促进炎症发生及诱导细胞凋亡等。因此,GSK-3β成为抗AD药物研究的重要靶点之一。本研究致力于发现新型的ATP竞争性GSK-3β抑制剂,研究内容主要分为以下四个部分:一、为发现兼具抗氧化应激和靶向金属内稳态失衡的新型多功能GSK-3β抑制剂,本研究以吡咯并哌啶酮类GSK-3β抑制剂的结构为基础,在保留与铰链区结合的吡啶酰胺片段的同时,用具有金属螯合作用的2,3-二氨基吡啶结构单元替换吡咯哌啶酮母核,并采用酰胺、亚胺和CH2NH桥连接,设计合成了靶向AD多环节的新型2,3-二氨基吡啶类GSK-3β抑制剂。其中,酰胺类2,3-二氨基吡啶类衍生物通过2-环丙基甲酰胺基异烟酸与取代的2,3-二氨基吡啶的缩合合成;亚胺类衍生物是通过2-环丙基甲酰胺基吡啶-3-甲醛与取代的2,3-二氨基吡啶反应合成;亚胺类衍生物经NaBH4还原,合成通过CH2NH桥连接的衍生物。酰胺类衍生物A01-A06具有一定的GSK-3β抑制能力,但与Cu2+、Zn2+和Al3+螯合能力较弱。亚胺类衍生物A07、A08和A11具有优良的GSK-3β抑制剂（IC50=38-71 nM）和选择性Cu2+、Al3+螯合能力。1,2-二氨类衍生物A18-A22是强的金属螯合剂,却减弱甚至丧失了 GSK-3β抑制活性。在体外抗AD活性评价中,化合物A07、A08和A11,特别是A08,具有良好的ROS抑制和自由基清除能力,能抑制Cu2+诱导的Aβ聚集,促进Cu2+-Aβ复合体解聚。在细胞试验中,化合物A07、A08和A11能抑制tau蛋白异常磷酸化,保护神经细胞免于Cu2+-Aβ及H2O2诱导的细胞损伤。化合物A08还被预测具有类药性和血脑屏障穿透的能力。通过上述研究,首次发现了兼具抗氧化应激和靶向金属内稳态失衡的新型多功能GSK-3β抑制剂A08。二、基于吡啶并吡咯类GSK-3β抑制剂的结合模式和特点,通过在Ⅰ区引入金属螯合结构单元,并通过不同的连接片段（Linker）,连接伸向Ⅲ区的芳香基团,设计了新型多靶向作用的吡啶并吡咯类GSK-3β抑制剂。以N-苯磺酰基保护的5-溴-3-碘-7-氮杂吲哚为原料,通过Suzuki偶联反应,引入邻羟基苯乙酮结构单元。脱去苯磺酰基保护基,再通过Suzuki偶联反应,引入Linker和Ⅲ区的结合基团,合成了化合物B01-B05。采用类似的合成策略,经一系列化学变换,合成了含8-羟基喹啉结构单元的吡啶并吡咯衍生物B06-B10。在浓度为1 μM时,B01-B09对GSK-3β没有抑制作用或只有极低的抑制活性。化合物B05具有选择性螯合Cu2+、Al3+的能力,并能抑制Cu2+诱导的Aβ1-42聚集,促进Cu2+诱导的Aβ1-42聚集体的解聚。8-羟基喹啉衍生物B10对GSK-3β具有良好的抑制活性,抑制率为89.7%。B10具有较强的Fe2+、Zn2+、Cu2+、Al3+螯合能力和ROS清除活性。更重要的是,B10能直接作用于Aβ1-42,显著抑制Aβ1-42自身的聚合,促进Aβ1-42聚集体的解聚。此外,B10能显著地抑制Cu2+诱导的Aβ1-42聚集,促进Cu2+诱导的Aβ1-42聚集体的解聚。因此,本研究首次发现了直接作用于Aβ,并兼具抗氧化应激和靶向金属内稳态失衡的新型GSK-3β抑制剂B10。三、为发现高效GSK-3β抑制剂,本研究采用增强与铰链区氢键结合的化合物设计策略,以氨基吡唑环作为铰链区的结合基团,期待其与铰链区的关键氨基酸ASP133、TYR134和VAL135形成多重氢键,设计了吡啶并吡唑类GSK-3β抑制剂。以2-氯-5-溴吡啶-3-甲腈为原料,通过与水合肼缩合,构建了溴取代的吡啶并吡唑胺母核。将氨基丁磺酰化后,通过Suzuki偶联反应,引进3-吡啶或取代的3-吡啶基团以及4-邻羟基苯乙酮片段,合成了吡啶并吡唑衍生物C01-C10。在浓度为1 μM时,C01-C10对GSK-3β只有较低的抑制作用,抑制率<50%。化合物C05、C06和C07对Cu2+有一定的螯合作用,但这些化合物对Cu2+诱导的Aβ1-42聚集没有作用,解聚Cu2+-Aβ1-42聚集体的能力微弱。四、为进一步验证基于增强与铰链区氢键结合的化合物设计理念,同样以氨基吡唑环作为铰链区的结合片段,设计了新型噻吩并吡唑类GSK-3β抑制剂。将噻吩并吡唑胺用Boc保护后,在5-位引入溴原子,脱去Boc,再经Suzuki偶联反应,引入4-乙酰基-3-羟基苯基、3-吡啶基或3-芳基取代的吡啶基团,合成了 8个D系列衍生物。采用同样的合成策略,合成了 10个含N-C-C-N或N-C-C-O螯合片段的E系列噻吩并吡唑衍生物。D系列化合物对GSK-3β具有强抑制作用,化合物D01、D03和D05的IC50分别为36、37和31 nM。另外,D01、D03和D05还能选择性螯合AD相关的金属离子,具有一定的抑制Cu2+诱导的Aβ1-42聚集和解聚Cu2+-Aβ1-42聚集体的作用。E系列化合物对GSK-3β的抑制作用较弱,部分化合物,如E02、E08和E10,具有一定的螯合AD相关的金属离子的能力,对Cu2+诱导的Aβ1-42聚集和Cu2+-Aβ1-42聚集体具有一定的作用。总之,为发现多靶向抗AD药物,本研究以GSK-3β为靶点,设计合成了2,3-二氨基吡啶系列（A01-A22）、吡啶并吡咯（B01-B10）、吡啶并吡唑（C01-C10）和噻吩并吡唑（D01-D08;E01-E10）类GSK-3β抑制剂。首次发现了兼具抗氧化应激和靶向金属内稳态失衡的强效GSK-3β抑制剂A08;首次发现了能直接作用于Aβ,又兼具抗氧化应激和靶向金属内稳态失衡的新型GSK-3β抑制剂B10。B10可以作为先导化合物做进一步的结构修饰与评价。C与E系列衍生物GSK-3β抑制活性较弱,说明在抑制剂的精密设计方面还存在不足。D系列化合物对GSK-3β具有强抑制作用,还具有选择性螯合AD相关的金属离子、抑制Cu2+诱导的Aβ1-42聚集和解聚Cu2+-Aβ1-42聚集体的作用,这也为新型多作用型GSK-3β的设计奠定了基础。