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目的:本实验以肾病综合征大鼠模型为研究对象,探讨不同药物作用下,NO相关指标在肾病综合征中的变化,研究NO是否可通过AVP-NOS/NO-AQP2途径调控AQP2,影响肾病综合征水液代谢,并通过观察当归芍药散加黄芪与单用当归芍药散对肾病综合征大鼠的治疗作用对比,结合前期研究,进一步探讨当归芍药散加黄芪治疗肾病综合征的作用机制,为肾病综合征临床治疗提供新的方法,也为当归芍药散合用黄芪的临床应用提供实验基础。方法:第一部分不同药物干预下肾病综合征大鼠NO及相关指标的变化尾静脉注射阿霉素复制肾病综合征大鼠模型;将大鼠分为正常组、模型组、L-Arg组、L-NAME组、AVP组,连续给药四周;使用代谢笼收集各组大鼠24h尿液,BCA法测定大鼠24h尿蛋白;试剂盒检测大鼠血清AVP、NO,尿液NOx、AQP2水平;全自动生化分析仪检测血清肾功能指标BUN、Cr、TC、TG、TP、ALB;Western blot法检测大鼠肾组织nNOS、iNOS、AQP2蛋白表达。第二部分不同药物干预下IMCD3细胞NO及AQP2的变化MTT法筛选不同浓度AVP对IMCD3细胞损伤的研究;将细胞分为正常组、模型组、V1a R拮抗剂组、V1a R/V2R拮抗剂组;试剂盒测定IMCD3细胞上清液NO水平;Western blot法检测IMCD3细胞nNOS、iNOS、AQP2蛋白表达。第三部分当归芍药散加味黄芪对肾病综合征大鼠的药效学研究将肾病综合征大鼠分为正常组、模型组、当归芍药散组、当归芍药散加黄芪组、黄芪组、阳性药组;使用代谢笼收集各组大鼠24h尿液,BCA法测定大鼠24h尿蛋白;实验动物体组成测定分析仪测定大鼠体内阻抗数值;试剂盒检测血清Ig-M、Ig-G、IL-6水平;全自动生化分析仪检测血清肾功能指标BUN、Cr、TC、TG、TP、ALB以及大鼠尿液与血清Na+、K+、Cl-水平;HE染色观察肾组织形态。第四部分当归芍药散加味黄芪对肾病综合征大鼠AVP、NO、AQP2的影响将肾病综合征大鼠分为正常组、模型组、当归芍药散组、当归芍药散加黄芪组、黄芪组、V2R拮抗剂组;试剂盒检测血清AVP、NO,尿液NOx水平;RT-PCR检测肾组织V2RmRNA、AQP2mRNA表达;Western blot法检测大鼠肾组织nNOS、iNOS、AQP2蛋白表达。结果:第一部分不同药物干预下肾病综合征大鼠NO及相关指标变化1、尿蛋白检测结果显示,与正常组比较,大鼠于造模后第一周末和第二周末大鼠尿蛋白浓度逐渐升高,差异具有显著性意义（P<0.01）。与模型组比较,给药四周后,L-NAME组大鼠尿蛋白浓度有明显下降,L-Arg组与AVP组大鼠尿蛋白浓度上升,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。2、肾病综合征大鼠尿液NOx、AQP2含量有所上升,与正常组相比,差异具有显著性意义（P<0.01）;与模型组相比,L-NAME组大鼠尿液NOx、AQP2含量下降,L-Arg组与AVP组大鼠尿液NOx、AQP2含量均有升高,具有显著性差异（P<0.01,P<0.05）。3、ELISA法检测结果显示,与正常组比较,模型组大鼠血清AVP、NO含量增加,差异具有显著性意义（P<0.01）;与模型组比较,AVP组大鼠血清AVP含量明显增加（P<0.01）,L-Arg组与L-NAME组血清AVP含量较模型组差异不明显;L-Arg组与AVP组大鼠血清NO含量较模型组明显升高（P<0.01,P<0.05）,L-NAME组NO明显降低（P<0.01）,具有显著性差异。4、L-Arg组与AVP组大鼠血清BUN、Scr、TC、TG含量较模型组有进一步增加,差异具有显著性意义（P<0.01,P<0.05）,而L-NAME组血清BUN、Scr、TC、TG浓度均明显下降,具有显著性差异（P<0.01）。与正常组比较,模型组大鼠血清TP、ALB浓度明显降低,差异具有显著性意义（P<0.01）;较模型组而言,L-Arg组与AVP组大鼠血清TP、ALB含量降低,L-NAME组则呈相反趋势,差异均具有意义（P<0.01,P<0.05）。5、Western blot实验结果显示,与正常组比较,模型组大鼠iNOS、nNOS、AQP2蛋白表达量显著增加;与模型组比较,L-Arg组与AVP组大鼠肾组织iNOS、nNOS和AQP2蛋白表达量明显升高,L-NAME组明显下降。第二部分不同药物干预下IMCD3细胞NO及AQP2的变化1、MTT结果显示,与正常组比较,当AVP溶液浓度为1×10-6、1×10-7、1×10-8mol·L-1时,细胞基本死亡;当AVP溶液浓度为1×10-10、1×10-11 mol·L-1时,对细胞生长无明显抑制作用;当AVP溶液浓度为1×10-9 mol·L-1时,对细胞具有明显的抑制作用。2、IMCD3细胞上清液NO检测结果显示,AVP造模后,模型组细胞上清液中NO水平明显增加,差异具有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较,给以V1a R拮抗剂和V1a R/V2R拮抗剂后,IMCD3细胞上清液中NO水平有明显下降,差异具有显著性意义（P<0.05,P<0.01）。3、Western blot实验结果显示,与正常组比较,AVP溶液诱导后细胞iNOS、nNOS、AQP2蛋白表达量显著增加;给以V1a R拮抗剂和V1a R/V2a R拮抗剂作用后,IMCD3细胞中iNOS、nNOS和AQP2蛋白表达量明显降低,差异具有显著性。第三部分当归芍药散加味黄芪对肾病综合征大鼠的药效学研究1、大鼠于造模后第一周末和第二周末检测尿蛋白结果显示,造模后的大鼠尿蛋白浓度显著升高,且第二周上升高,差异具有显著性意义（P<0.01）。给药四周后,与模型组比较,给以相应药物治疗后,各组大鼠尿蛋白浓度均有明显下降,具有显著性差异（P<0.01）,且与单用当归芍药散相比,当归芍药散加黄芪组大鼠尿蛋白浓度下降更多。2、实验动物体组成测定分析仪测量结果显示,与正常组比较,造模大鼠体内总含水量TBW%数值明显下降,细胞外液ECF%数值明显上升,细胞内液ICF%数值明显下降,差异均具有显著性意义（P<0.01）;与模型组比较,各给药组大鼠体内TBW%数值升高,ECF%数值下降,ICF%数值上升;与单用当归芍药散组比较,当归芍药散加黄芪组TBW%数值升高明显,且趋于正常值。3、免疫指标检测结果显示,较正常组而言,模型组大鼠血清Ig-M、Ig-G、IL-6含量均明显下降,差异具有统计学意义（P<0.01）;其余各给给药组较模型组而言均有所升高,差异具有统计学意义（P<0.01）;与单用当归芍药散组比较,当归芍药散加黄芪组,大鼠血清Ig-M、Ig-G、IL-6含量上升更加明显,且Ig-M、Ig-G含量,差异具有统计学意义（P<0.05）。4、血清肾功能检测结果显示,与正常组比较,模型组血清BUN、Scr、TC、TG含量明显上升（P<0.01）;与模型组比较,各个给药组大鼠血清BUN、Scr、TC、TG浓度明显下降,具有统计学差异（P<0.01）;与单用当归芍药散组相比,当归芍药散加黄芪组大鼠血清BUN、Scr、TC、TG浓度下降更加明显,且BUN浓度下降具有显著性差异（P<0.05）。模型组大鼠血清TP、ALB浓度呈现相反趋势,与正常组相比,浓度明显降低,差异具有显著性意义（P<0.01）;较模型组而言,各个给药组大鼠血清TP、ALB含量升高（P<0.01）;较单用当归芍药散组而言,当归芍药散加黄芪组大鼠血清TP含量升高更加明显,差异均具有意义（P<0.01）。5、与正常组比较,模型组大鼠的血清Na+、K+、Cl-浓度明显下降,而尿液中Na+、K+、Cl-浓度呈现相反趋势,即明显升高,差异具有统计学意义（P<0.01）;给药后,各个组大鼠血清Na+、K+、Cl-浓度上升,尿液中Na+、K+、Cl-浓度下降;与单用当归芍药散组相比,当归芍药散加黄芪组大鼠血清和尿液Na+变化更加明显,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。6、HE染色结果显示,模型组大鼠肾组织中肾小球基底膜界限不清,有明显增生,肾小管上皮细胞可见颗粒变性或萎缩,可见蛋白管型;与模型组相比,当归芍药散组,当归芍药散加黄芪组以及黄芪组系膜细胞核基质增生情况有改善,肾小管病变减轻,足突融合程度无明显变化;与单用当归芍药散组相比,当归芍药散加黄芪组肾小球,肾小管病变程度减轻。第四部分当归芍药散加味黄芪对肾病综合征大鼠AVP、NO、AQP2的影响1、与正常组比较,模型组大鼠尿液NOx含量明显升高,差异具有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较,给药之后,大鼠尿液NOx水平有明显降低（P<0.01）;与单用当归芍药散组相比,当归芍药散加黄芪组降低大鼠尿液NOx水平更加明显,且差异具有统计学意义（P<0.01）。2、各组大鼠血清NO、AVP水平检测结果显示,与正常组比较,模型组大鼠血清NO、AVP水平有明显的上升,且具有显著性差异（P<0.01）;与模型组比较,各个给药组大鼠血清NO、AVP含量均有明显降低,差异具有统计学意义（P<0.01）;与单用当归芍药散组相比,当归芍药散加黄芪组降低血清NO、AVP含量更加明显,且差异性具有统计学意义（P<0.05）。3、RT-PCR结果显示,模型组大鼠肾组织V2RmRNA、AQP2mRNA表达较正常组而言具有明显的升高（P<0.01）;与模型组相比,各个给药组大鼠肾组织V2RmRNA、AQP2mRNA表达降低,其中当归芍药散加黄芪组和V2R受体拮抗剂组降低较为明显（P<0.01）;与单用当归芍药散组相比,当归芍药散加黄芪组大鼠肾组织V2RmRNA、AQP2mRNA表达差异具有统计学意义（P<0.01）。4、Western blot法检测结果显示,与正常组相比,模型组大鼠肾组织iNOS、nNOS、AQP2蛋白相对表达明显增多,差异具有统计学意义（P<0.01）;与模型组相比,给药之后,各组大鼠肾组织iNOS、nNOS、AQP2蛋白相对表达降低;与单用当归芍药散组相比,当归芍药散加黄芪组降低肾组织iNOS、nNOS、AQP2蛋白相对表达更加明显。结论:1、NO参与肾病综合征水液代谢发生机制且途径可能为AVP-NOS/NO-AQP2;2、当归芍药散加黄芪可改善肾病综合征大鼠肾损伤,且较单用当归芍药散治疗肾病综合征整体效果更好;3、当归芍药散加黄芪治疗肾病综合征可能与抑制AVP-NOS/NO-AQP2通路有关。