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为建立一套兔转基因克隆的技术体系,本研究对核移植重构胚的激活方法及体细胞和重构胚的重编程的处理方法进行了研究。
1、对转基因重构胚的激活方法进行了模索。将电融合后的重构胚随机分成三组,分别在M199培养液中培养0.5h、1.5h和2.5h后再进行化学激活,探讨融合-激活间隔时间对转基因克隆重构胚发育的影响,结果发现:随着融合-激活间隔时间的延长,重构胚的分裂率与囊胚率也逐渐增加,当间隔时间延长至2.5h时,重构胚的分裂率与囊胚率显著高于0.5h组(78.08％vs63.16％,31.51％vs17.11％,P＜0.05);将重构胚用Ion激活5min后,放入含2mmol/L 6-DMAP和5μg/mL CHX的培养液中分别培养1h、2h、3h,三组重构胚的分裂率没有显著差异(P＞0.05),但囊胚率随处理时间延长而呈现降低趋势,当时间延长到3h时,囊胚率显著低于1h组(13.89％vs28.57％,P＜0.05)。
2、探讨了TSA处理核移植供体细胞或克隆重构胚对兔转基因克隆胚胎早期发育的影响。转EGFP基因的兔胎儿成纤维细胞分别用浓度为5nmol/L、25 nmol/L、50nmol/L TSA处理24h后进行核移植,结果发现,当TSA浓度为5nmol/L时,重构胚的分裂率和囊胚率显著高于对照组(0nmol/L)(482.61％vs72.09％;41.30％vs26.74％,P＜0.05),而25nmol/L组与对照组之间没有显著差异(P＞0.05),而浓度增加到50nmol/L时,重构胚的分裂率与囊胚率显著低于对照组(51.95％vs72.09％;11.69％vs26.74％,P＜0.05)。转EGFP基因克隆重构胚分别经5nmol/L、50nmol/L、100nmol/L的TSA处理6h后发现,50nmol/L组的重构胚分裂率(84.09％)显著高于对照组(70.24％)、5nmol/L(75.00％)组和100nmol/L组(71.76％)(P＜0.05),囊胚率(42.05％)显著高于对照组(27.38％)和100nmol/L组(25.88％)(P＜0.05)。用50nmol/L TSA分别处理重构胚3h、6h、9h后,6h组的分裂率和囊胚率显著高于对照组(83.17％vs70.51％;41.58％vs26.92％,P＜0.05),而3h、9h组与对照组没有显著差异(P＞0.05)。将196枚经TSA处理过的转基因兔体细胞克隆胚胎分别移植给10只受体兔,其中1只怀孕到期,产下2只克隆兔。
以上结果表明:(1)兔转基因克隆重构胚融合-激活间隔的适合时间约为2.5h,激活后在6-DMAP+CHX中培养1h,有利于兔转基因克隆胚胎的发育;(2)用5nmol/L的TSA处理供体细胞24h或50nmol/L的TSA处理兔转基因克隆重构胚6h均可提高转基因克隆胚胎发育率,且培养获得的兔转基因克隆胚胎移植后可妊娠并发育到期,获得克隆仔兔。