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烟草中的N基因是第一个被克隆的编码Toll-interleukin-1 receptor/nucleotide-binding site/leucine-rich repeat (TIR-NBS-LRR)结构域的植物抗病基因,它能够通过介导在侵染位点的过敏反应(hypersensative response,HR)形成对烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)的抗性。存在于TMV复制酶羧基端的50 kDa解旋酶基序的氨基酸序列就能够在含有N基因的烟草中引发过敏反应,即是N基因对应的无毒基因。这段TMV的p50序列通过遗传转化导入到感病的烟草中,形成转基因植株,称为转基因P50植株。将纯合的转基因P50植株与纯合的NN烟草栽培种SamsunNN进行杂交,杂交种中同时含有N基因及其无毒基因P50。当种子萌发1-2星期后,这些F1代的烟草幼苗发生系统性的过敏反应而死亡,只有在N基因或p50发生突变而失去功能的情况下,杂交幼苗才能够存活下来。本研究获得了91万SamsunNN和转基因P50的F1代杂交种子。这些种子发芽后绝大多数在2周内死亡,只有350株存活。通过离体叶片TMV侵染等方法对这些存活苗突变类型的鉴定,发现其中41株存活烟草不对TMV发生HR反应,表明N基因发生了功能缺失突变。因此,N基因功能缺失突变频率大致为1/22000。之后我们设计了一系列N基因的特异性引物对突变体中的N基因进行PCR扩增,其中40个突变体用任何一对N特异性引物都扩不出PCR产物,表明整个N基因缺失。而另一株突变体可以扩增得到PCR产物,产物的测序结果显示这个N基因的突变类型为点突变,导致氨基酸序列的第1008位的F(苯丙氨酸)突变成为L(亮氨酸)。与此同时,本研究分析了烟草栽培种Hicks broadleaf中N基因家族序列。通过对其基因组数据库的数据挖掘和PCR的扩增,共得到了10条全长和96条非全长的N基因同源体序列,详细分析这些序列未发现任何基因交换(gene conversion)。用N基因特异性引物对Nicotiana glutinosa 7个基因型中的N基因进行PCR扩增和测序,得到了这7个基因型中的N基因全长序列,这些等位基因高度的保守。N基因的突变方式(缺失突变)、不与同源序列发生序列交换、在自然群体中高度保守等特点说明N基因具有典型的TypeⅡ类抗病基因的进化模式。