RNA干涉技术平台的建立及肝癌侵袭转移相关基因RNA干涉研究

来源 :中国人民解放军军事医学科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ice_city_82
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肝癌是常见的恶性肿瘤之一,世界上每年约有100万例病人死亡,其发病率与病死率之比高达1:0.98。肝癌的病死率如此之高,根本原因之一是其高侵袭转移性所致。肝癌的侵袭转移是一个多步骤,有多因素参与的极其复杂的过程。本文以RNA干涉为主要手段,试图将肝癌侵袭转移不同步骤中的相关基因(HPO、c-met和MT1-MMP基因)沉默,从而为建立抑制肝癌侵袭转移的细胞模型和体内外抑癌效应机理及基因治疗的研究奠定基础。 在本研究中,首先建立了一套基于载体策略的RNA干涉实验技术平台。H1启动子为Ⅲ型的RNA聚合酶Ⅲ(Pol Ⅲ)启动子,由于可在人类细胞中高水平地表达目的RNA分子,以及其所有的顺式作用元件皆位于待转录物的5′外侧区域,因此非常适于RNA干涉载体的构建。利用全长374bp的H1启动子序列构建了四种RNA干涉载体:pSL、带有绿色荧光蛋白(EGFP)标签的pESL、pcDDH和pRDH。就干涉载体pSL和pESL而言,以RNA干涉p53基因为例,并以只包含H1启动子末端100bp序列的商品化载体pSilencerTM 3.1-H1 hygro为阳性对照,验证了它们的干涉效率。实验结果表明,pSL和pESL不但能够高效的抑制目的基因的表达,而且与pSilencerTM 3.1-H1 hygro相比,具有更高的干涉效率。这为进一步针对不同基因进行RNA干涉和功能研究提供了重要工具。pcDDH和pRDH皆由反向重复的H1全长启动子构建而成,可在细胞内直接转录产生siRNA,适于在H1启动子间插入随机序列,用于构建RNA干涉文库。另外,pRDH为逆转录病毒载体,在利用逆转录病毒包装后可高效的导入目的细胞,以使在那些原来难以转染siRNA或质粒DNA的原代细胞中进行基因沉默成为可能。 另外,鉴于T载体在分子生物学实验中应用的普遍性及商品化载体的高昂价格,我们构建了一种高效T载体并成功应用于实验。 肝细胞生成素(HPO)是我们研究所首先克隆的一种能特异刺激肝源细胞增殖的细胞活性因子。HPO可激活MAPK途径和AP-1转录活性,参与调控多种与
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