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骨骼是少数几个在个体成熟后仍保留有潜在再生能力的器官之一,亦是唯一一种在整个生命周期中都保持持续重塑功能的组织。高效的骨再生能力对临床上治疗许多骨骼肌肉系统疾病具有重要意义,如节段性骨缺损、骨不连及脊柱融合失败等。胚胎发育时,骨发生是一个连续的、涉及众多细胞活动的演化过程。在骨骼系统发育过程中,骨发生有两种主要的方式,膜内成骨和软骨内成骨。而骨折后的骨再生过程则是一个类似于软骨内成骨的连续过程,其起始于间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的化学趋化与增殖。间充质干细胞在生物组织工程和再生医学领域有着十分巨大的潜力和广泛的应用前景。MSCs依附于骨髓间充质细胞,可向成骨、成软骨、成脂及成肌等多方向分化。研究表明,有数条信号通路对干细胞的自我更新及种系维持起作用。骨形态形成蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMPs)在胚胎发育过程中对细胞的增值和分化起重要调节作用,其在干细胞生物学中也扮演重要角色。BMPs属于转化生长因子(Transforming growth factor,TGF)超家族,在人体内至少有15中不同的亚型存在。BMPs基因表达的异常可导致发育过程中多种骨骼和非骨骼系统畸形的发生。BMPs通过与BMP受体异二聚体结合并相互作用来激活其信号通路。BMP受体(BMP receptor,BMPR)具有两种亚型,I型BMP受体(BMPR type I,BMPR-I)和II型BMP受体(BMPR type II,BMPR-II)。活化的受体激酶可磷酸化转录因子Smad1、Smad5或Smad8,磷酸化的这些R-Smad因子将于Smad4结合,定位转移至细胞核内,与其它协同活化因子一道促进目的基因的表达。本实验是前期系统的研究了14种不同BMPs,发现BMP9是其中可在体内、外诱导间充质干细胞成骨分化作用最强的BMPs因子。本实验的研究还进一步揭示了BMP9对BMP介导的MSCs向成骨细胞分化过程中的一系列下游基因具有重要的调节作用。BMP9(亦被称为生长分化因子2,GDF2)最早在胚鼠肝脏中发现,其功能主要包括介导和维持胚胎基底前脑胆碱能神经的胆碱能表型,抑制肝糖原产生和介导脂代谢相关关键酶的表达,刺激鼠肝性杀菌多肽1的合成等。虽然人们对BMP9在骨骼肌肉系统内的作用和功能的认识并不深入,但是其潜在的诱导成骨活性显示出其可作为一种高效的再生因子的可能性。根据本实验前期研究的结果,我们相信其它生长因子可对BMP9介导的骨形成产生协同作用,从而更有效的诱导、促进成果过程。在本文中,作者针对胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1, IGF1)在BMP9介导的成骨过程中的作用进行了研究。作为IGF信号通路的成员之一,IGF1在胚胎生长、发育过程中具有重要作用。IGF1通过与IGF1受体结合,可活化PI3K/AKT通路或MAPK通路。Igf1基因敲除小鼠的出生重量较野生型小鼠低40%,这说明IGF1在胚胎发育中起重要作用。在本研究中,作者发现间充质干细胞的内源性IGF1量非常低。外源性表达IGF1可明显增强间充质干细胞内BMP9介导的早期成骨指标——碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)的活性。对间充质干细胞内由BMP9介导的中、晚期成骨指标——骨钙素(Osteocalcin,OCN)、骨桥素(Osteopotin,OPN),IGF1亦有明显的促进其合成表达的作用。同时,Alizarin Red S染色显示IGF1还可增强BMP介导的间充质干细胞钙化的作用。在干细胞异位移植成骨实验中,IGF1可增强BMP9介导的干细胞异位成骨能力。利用胚胎鼠肢体组织培养,我们发现IGF1自身可增加胚鼠肢体骨软骨增值区(Proliferation Zone)的活性和软骨肥大区(Hypertrophic Zone)的扩展;IGF1、BMP9共同使用可对胚胎骨的生长和成骨分化有更强的促进作用。在对IGF1增强BMP9介导间充质干细胞成骨作用的机制研究中,作者发现外源性IGFBP3、IGFBP4和IGFBP5可以导致IGF1对BMP9介导的ALP活性的增强作用失效。进一步,IGF1可增强BMP9介导的BMPR-Smad报告子活性、Smad1/5/8的磷酸化及其向核内定向转移的程度。然而,BMP9单纯作用并不能明显介导AKT的磷酸化活化,PI3K特异性抑制剂LY294002不仅可阻断IGF1对BMP9介导的成骨信号的促进作用,亦可直接抑制BMP的活性,说明在间充质干细胞内BMP9与IGF1可能通过PI3K/pAKT通路来实现两者间的交叉调控。