论文部分内容阅读
白细胞介素-18（Interleukin-18，IL-18）是一种在机体免疫调控中具有重要作用的细胞因子。IL-18生物学活性具有多效性，在诱导多种细胞因子产生尤其是IFN-γ、介导淋巴细胞的细胞毒活性和调节免疫功能等方面发挥重要作用。根据GenBank基因序列号为NM213997的猪IL-18基因序列，设计并合成了特异性引物，采用RT-PCR技术，以ConA刺激的内江猪和荣昌猪外周血单核淋巴细胞（PBMC）总RNA为模板，分别扩增出其IL-18基因，将两基因分别克隆到pMD18-T载体上并测序，测序结果表明其开放阅读框有579个碱基，编码193个氨基酸。对内江猪、荣昌猪IL-18核苷酸序列及推导氨基酸序列与其他国内外IL-18进行同源性比较，以及变异分析，结果显示，内江猪和荣昌猪IL-18序列核苷酸同源性为99.0％，氨基酸同源性为97.9％；内江猪、荣昌猪与GenBank上其他猪IL-18相比，核苷酸序列同源性在98.6％～99.5％之间，氨基酸序列同源性均在97.4％以上；内江猪的氨基酸序列变异有两处，荣昌猪有三处；内江猪和荣昌猪IL-18蛋白的理化特性相似；密码子偏向性不大。采用PCR技术，以内江猪IL-18基因克隆载体为模板，扩增出成熟蛋白的编码基因（471 bp），并将其插入pET-32a（+）表达质粒，构建了内江猪IL-18成熟蛋白原核表达质粒。阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达重组成熟蛋白，SDS-PAGE，Western-blot证实表达出35 kD左右的融合蛋白，并检测其可溶性。试验确定内江猪IL-18重组成熟蛋白表达的最佳条件为IPTG 0.2 mmol／L，30℃诱导培养5 h，在最佳表达条件下，重组成熟蛋白表达的相对含量可达到49.6％。重组成熟蛋白纯化复性后，MTT法测定表明其具有一定的刺激猪外周血单核淋巴细胞增殖的活性。本试验利用RT-PCR技术在国内首次克隆出内江猪和荣昌猪的IL-18基因，构建了内江猪IL-18成熟蛋白的原核表达系统，实现了内江猪IL-18重组成熟蛋白的高效表达，初步测定其生物学活性，为进一步研究IL-18的结构、生物学活性及其作用机制提供了理论基础。