【摘 要】
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本论文综述回顾了近几年前体加工酶及其抑制剂研究领域的一些新进展.论文实验部分的主题是绿豆胰蛋白酶抑制剂的基因克隆及其蛋白表达的研究.从天然中纯化的绿豆Bowman-Birk
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本论文综述回顾了近几年前体加工酶及其抑制剂研究领域的一些新进展.论文实验部分的主题是绿豆胰蛋白酶抑制剂的基因克隆及其蛋白表达的研究.从天然中纯化的绿豆Bowman-Birk抑制剂(MBTI)具有较强的对kexin的抑制活力,其Ki达到10<'-10>M(接近10<'-11>M)的水平,而对Furin的抑制活力较低,其Ki仅约为13 μM.根据已知的抑制剂蛋白质序列,选择同源保守区域设计引物,采用RACE方法,从发育的绿豆种子的总RNA中克隆了它的cDNA并进行了序列测定.构建了重组质粒pMAL<'TM>-p2X-Ek-MBTI与pMAL<'TM>-p2X-Ek-ProMBTI并在转入大肠杆菌菌株BL21后诱导表达分泌出融合蛋白.融合蛋白被在引入的enterokinase酶切位点充分酶切水解后去除MBP,分离纯化了由74氨基酸残基组成的绿豆胰蛋白酶抑制剂.测定了绿豆胰蛋白酶抑制剂融合蛋白MBP-Ek-MBTI及N端带有12个氨基酸残基前体肽的融合蛋白MBP-Ek-ProMBTI对胰蛋白酶的抑制活力,发现前体肽对绿豆胰蛋白酶抑制剂在大肠杆菌中的分泌表达没有明显作用.在与天然提取绿豆胰蛋白酶抑制剂的抑制活力比较后,它们对胰蛋白酶的抑制解离常数Ki都约为3~4nM,从而确定了活性绿豆胰蛋白酶抑制剂成功得到表达.
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