1.目的:　　 食管鳞状细胞癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一。由于缺乏敏感、特异的早期诊断手段,多数食管癌患者首次确诊时已属中晚期,尽管包括手术、化疗及放射治疗等在内的多学科综合治疗手段近年来取得了明显的进步,中晚期食管鳞状细胞癌患者的预后依然很差,5年生存率仅为约10％,而早期食管癌术后5年生存率超过92.6%。因此,开发能用于食管癌早期诊断的分子生物学工具和方法,对于食管癌预后的根本性改善具有重要意义。近年来国内外学者对食管癌早期诊断的分子标志物做了大量有益的研究,但是食管癌发生的机制尚未阐明,食管癌特异性基因和抗原也尚未发现。癌的发生是一个复杂的多阶段的生物过程,其中就包括基因表达谱的改变。了解食管鳞状细胞癌的基因表达模式和食管鳞状细胞癌发生的重要机制将有助于我们开发能够用于食管癌诊断、预后预测以及治疗的工具,进而改善预后。目前,已开展了一些研究去发现和鉴定与其发生或转移相关的基因。然而,到目前而至,尚缺乏对这些基因表达谱进行全面的生物信息学分析,而对基因表达谱进行生物信息学分析将有助于我们洞悉食管鳞状细胞的发生和转移的分子机制,也将有助于我们开发能够早期诊断食管癌、早期检测食管癌复发和转移的分子标记物。　　 本研究首先采用DNA芯片技术对食管鳞状细胞癌组织及正常食管粘膜上皮组织全基因组基因表达情况进行分析,旨在揭示食管鳞状细胞癌患者癌组织和正常食管粘膜上皮组织间差异表达的基因谱,同时采用生物信息分析技术推断这些差异表达的基因在食管鳞状细胞癌的发生、发展中的作用;进而,我们从前期研究发现的在食管鳞状细胞癌中表达明显上调的基因中选取CASG3B、IL24,表达明显下调的基因中选取SPINK8和CAB39L,应用Western-blot方法和免疫组织化学SP法检测它们在食管鳞状细胞癌组织中的表达,探讨它们与食管鳞状细胞癌侵袭、转移的相关性。　　 2.资料与方法　　 2.1患者和样品　　 45例人食管鳞癌组织标本均来源于河南省肿瘤医院2008年7月-2008年11月手术切除的食管鳞状细胞癌患者。其中,男性31例,女性14例。年龄47-75岁,平均年龄为62.4岁。有淋巴结转移27例,无淋巴结转移18例。均在河南省肿瘤医院接受外科治疗。术前所有患者均签署知情同意书。术前均未接受放化疗。该研究计划方案经过郑州大学医学伦理学术委员会批准。所有食管鳞状细胞癌的诊断均得到至少两个有经验的病理医师出具的组织学诊断。依据UICC第7版TNM分期系统进行食管癌分期。　　 原发肿瘤组织和正常食管粘膜上皮组织(距肿瘤边缘大于5cm),在离体后立即置入RNALater液中保存,并移入-80℃深低温冰箱中保存。　　 2.2 RNA提取和基因芯片分析　　 首先,对其中4例患者原发肿瘤组织和正常食管粘膜上皮组织进行基因芯片分析。　　 采用TRIzol试剂,按照厂家建议的步骤进行全RNA提取;然后,使用分光光度计进行定量;cRNA的扩增和生物素标记使用Illumina Total PrepRNA扩增试剂盒进行(Ambion,Austin,TX,USA);过夜反应,使cDNA在体转录为cRNA,cRNA产物经biotin-11-dUTP标记;cRNA产量采用分光光度计定量;然后,提取500ng标记的cRNA在包含48000探针的人RefV3珠链芯片(Illumina,SanDiego,CA,USA)上,55℃过夜进行杂交:随后使用浓度为1μg/ml的streptavidin-Cy3(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)染色进行显像;采用Illumina公司的the Sentrix BeadChip and BeadStation芯片分析系统进行基因表达分析。杂交、标记、染色、背景噪音及每条芯片上“看家”基因表达的基础水平的质量标准均经过验证。对芯片探针扫描后采用Illumina公司的BeadStudio软件进行图像分析。　　 2.3差异表达基因的生物信息学分析　　 从BeadStudio上获得的原始丰度数据输入到GeneSpring GX11.0(AgilentTechnologies,Santa Clara,CA,USA)上接受进一步分析。采用配对t检验以获得在癌组织和正常食管上皮组织差异表达水平不少于2倍的探针集合(P＜0.01)。进行平均距离法分层聚类分析,基于所有基因的经Log值转换的信号强度值,采用Pearson中心距离度量作为衡量每个配对样本中基因表达模式相似性的手段。使用GeneSpring GX11.0上的基因本体分析选项检测所参与的最显著的生物学过程。将BioPAX通路/网络转换方程输出到GeneSpring GX。然后,用所发现的最显著的细胞通路工具去确定哪一个生物学通路中存在差异表达基因目录中基因的富集。在GeneSpring GX软件上,采用前述方法进行基因集合分析。　　 2.4 SDS-PAGE和Western-blot　　 从前期研究发现的在食管鳞状细胞癌和正常食管粘膜上皮中表达明显上调的前十位基因中选取分别选取CASG3B、IL24,表达明显下调的前十位基因中选取SPINK8和CAB39L,应用Western-blot方法和免疫组织化学SP法检测其在45例食管鳞状细胞癌组织中的表达。　　 将标本称量后,按照0.1g加入5ml缓冲液的比例加入冰预冷的PBS,冰浴条件下充分研磨,1000rpm离心5分钟,收集上清,每100μl分装一管。然后进行SDS-PAGE和Western-blot,用兔抗人多抗来检测在不同标本中的表达情况。　　 每种都用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPIT)作为内参照。　　 方法如下:　　 SDS-PAGE结束后,将凝胶转移到转移缓冲液中,按照同样的尺寸剪好PVDF膜,先在甲醇中浸泡5秒,与凝胶在转移缓冲液中共同孵育10分钟;　　 将PVDF膜与凝胶夹在Whatman滤纸中,放入转移电泳槽,稳压200mA,持续转移4个小时;　　 将负样的PVDF膜放进PBST缓冲液中漂洗5分钟,然后37℃下用PBST配置的5%BSA封闭30分钟,每10分钟晃动一次;　　 用充足的PBST洗膜三次,每次5分钟,充分吸去未附着的BSA;　　 用PBST1:2000稀释兔抗人一抗,37℃孵育60分钟,每10分钟晃动一次;　　 用充足的PBST洗膜三次,每次5分钟,充分吸去未附着的一抗;　　 用PBST1:200稀释HRP标记的羊抗兔二抗,37℃孵育60分钟,每10分钟晃动一次;　　 用充足的PBST洗膜三次,每次5分钟,充分吸去未附着的二抗;　　 用DAB溶液显色。　　 2.5免疫组织化学(SP法)　　 常规石蜡包埋组织,切片厚度5μm,常规脱蜡、复水,3%H2O2孵育10分钟,双蒸水冲洗后,PBS浸泡5分钟;　　 用微波炉进行抗原修复,处理lO分钟,自然冷却后PBS冲洗三次,每次三分钟;　　 样品滴加正常山羊血清工作液,37℃孵育20分钟;　　 滴加兔抗人多克隆抗体,4℃孵育过夜;　　 用冰预冷的0.01M pH7.4的PBS冲洗三次,每次三分钟;　　 滴加生物素标记的羊抗兔IgG,37℃孵育30分钟,PBS冲洗三次,每次三分钟:　　 滴加SP复合物,37℃孵育30分钟,PBS冲洗三次,每次三分钟;　　 DAB显色后,蒸馏水冲洗,苏木素复染后,常规乙醇脱水、二甲苯透明,中性树脂封片。　　 其他三种抗体检测流程同上,并均用PBS代替一抗做阴性对照。　　 阳性结果判断标准:　　 经抗体染色后,每例切片在光学显微镜下观察10个具有代表性的高倍视野,以细胞浆内或核上呈现棕黄色颗粒为阳性。　　 统计学处理:　　 数据处理采用软件SPSS13.0进行X2检验,检验水准取α=0.05。　　 3.结果　　 3.1食管鳞状细胞癌组织和正常食管上皮组织基因表达的总体差异　　 采用Illumina HumanRef6V3珠链芯片(包含480000个探针以检测人mRNA),我们比较了四例原发性食管鳞状细胞癌患者的癌组织和配对正常食管上皮组织的基因表达谱。经过配对t检验,我们发现570个基因(590个探针集)存在2倍以上的差异表达,这些基因中,303个基因在癌组织中表达上调,267个基因在癌组织中表达下调。然后分选后进行分层聚类分析,每次比较都是在两个大组间进行,即下调的基因组和上调的基因组,火山图上分别用绿色和红色表示。该聚类将食管鳞状细胞癌组织集合在一起,将食管鳞状细胞癌组织和正常食管上皮组织区分开来,而且不同病理分期的食管鳞癌组织中基因差异表达模式的相似性存在一定差异。　　 3.2基因本体论分析　　 所有差异表达的基因均采用GeneSpring GX11.0软件上GO选项进行分析,产生了17个明显的GO产品(校正的P＜0.05)。前5位GO产品分别是:1)细胞外区(校正的P=4.48E-11);细胞外区部分(校正P=6.08E-08);胶原蛋白(校正P=1.76E-05);细胞外基质(校正P=5.56E-04);肽链内切酶抑制子活动(校正P=0.001229)。在这些GO产品中,我们发现许多的基因参与基质金属蛋白酶和胶原蛋白活动。此外,一些基因参与肽链内切酶抑制子活动。　　 3.3重要细胞通路的发现和基因集合分析　　 采用发现的重要细胞通路和公共细胞通路数据,我们发现7条细胞通路或细胞网路与这些差异表达的基因有密切关系(P＜0.05):(1)抑制基质金属蛋白酶活性(P=0.023);(2)传导信号至ERKs(P=D.035);(3)通过NGF进行信号传导(P=0.029);(4)FGF信号传导通路(P=0.003);(5)N-cadherin信号传导活动(P=0.035);(6)凋亡中半胱天冬梅瀑布级联反应(P=0.007);(7)血管生成中的整联蛋白(P=9.24E-04)。基因集合分析显示:包含15个配对基因的POD-1_KO_UP基因集合(MIT Broad list C2,P＜0.029)明显富集。　　 3.4 Western blot结果　　 CASG3B、IL24、SPINK8和CAB39L在正常食管组织和食管鳞状细胞癌组织中均可见表达。较正常食管粘膜上皮组织相比,CASG3B和IL24在食管鳞状细胞癌组织中的表达上调;SPINK8和CAB391,在食管鳞状细胞癌组织中的表达下调。这与基因芯片研究结果相一致。　　 3.5免疫组化SP法结果　　 3.5.1 CASG3B在食管鳞状细胞癌组织中的表达率46.7%(21/45),有淋巴结转移组阳性表达率51.9%(14/27)与无淋巴结转移表达率无显著差异38.9%(7/1.8)(P＞0.05);　　 3.5.2 IL-24在食管鳞状细胞癌组织中表达率较高55.6%(25/45),有淋巴结转移组阳性表达率70.4%(19/27)显著高于无淋巴结转移组阳性表达率33.3%(6/18)(P＜0.05);　　 3.5.3 SPINK8在食管鳞状细胞癌组织中表达率较高68.9%(31/45),有淋巴结转移组阳性表达率55.6%(15/27)显著低于无淋巴结转移组阳性表达率88.9%(16/18)(P＜0.05);　　 3.5.4 CAB39L在食管鳞状细胞癌中的表达率较低,为13.3%(6/45),有淋巴结转移组阳性表达率14.8%(4/27)与无淋巴结转移表达率11.1%(2/18)无显著差异(P0＞0.05)。　　 4.结论　　 4.1大量基因通过各种细胞过程和细胞通路参与食管鳞状细胞癌的发生发生、发展。　　 4.2 CASG3B和CAB39L在食管鳞状细胞癌侵袭和转移中的作用,需要进一步的研究;　　 4.3 IL-24和SPINK8可能与食管鳞状细胞癌的侵袭、转移密切相关。