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高F值寡肽是蛋白酶作用于食物蛋白后形成的一种低分子量生理活性肽,其中支链氨基酸(BCAA)即亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、缬氨酸(Val)含量高,而芳香族氨基酸(AAA)即苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)含量低,即反映两者的摩尔比的F值(Fischerratio)高。它除具有营养功能且更容易被人体消化吸收以外,还有广泛的生理调节功能,如辅助治肝硬化和肝性脑病等特殊保健功能。利用低值鱼制备高F值寡肽,不仅可以作为鱼蛋白精深加工的一种产物,也是开发其作为生化制药、保健食品的一条有效途径。
本文研究了鱼蛋白的两步酶解工艺及其肽谱分析,建立了高速逆流色谱(High speedcounter-current chromatography,HSCCC)和pH-区带精制逆流色谱(pH-zone refiningcounter-current chromatography,pH-zone refining CCC)一步分离、制备富含高F值寡肽的方法,为从低值鱼蛋白酶解液中分离制备生物活性肽建立了一个新颖、实用的方法体系。主要研究内容和结果如下：
一、鱼蛋白的两步酶解及酶解液肽谱分析通过比较鲮鱼和草鱼的氨基酸组成和蛋白质含量,选定鲮鱼作为分离制备高F值寡肽的原料。鲮鱼鱼糜经胃蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶酶解,再经截留分子量为3kD的超滤膜处理并冷冻干燥后,氨基酸分析测得其F值为12.02,这与应用紫外分光光度计所做的F值估测基本上一致。
研究确定HPLC肽谱分析的优化条件为：样品为C组分(MW<1kD),Symmetry 300C18柱(250×4.6 mm,5μm),流动相为A：乙腈(含0.1％三氟乙酸)和B：双蒸水(含0.1％三氟乙酸),柱温37℃,流动相流速为0.8 mL/min,进样量为20 μL,检测波长为214nm、280 nm。在30 min内,洗脱梯度为：0～10 min B相的比例从90％→87％,10～11min B相的比例从87％→85％,11～20 min B相的比例从85→65％,20～24 minB相的比例从65％回升到90％,维持6 min。
酶解液的全波长扫描肽谱分析显示：鲮鱼鱼肉蛋白两步酶切后,产生了多个在214nm(支链氨基酸特征峰)和280 nm(芳香族氨基酸特征峰)下有吸收的峰,这表明两步酶解已把某些肽段上的芳香族氨基酸切掉,出现了完全不含芳香族氨基酸的寡肽。
二、高速逆流色谱分离制备高F值寡肽研究建立了制备高F值寡肽的高速逆流色谱分离优化条件：150mg样品(B1组分)溶于2ml 1:1的上下相混合溶液中。通过系统优化,确定在溶剂体系甲基叔丁基醚：正丁醇:乙腈:水=2:2:1:5(V:V:V:V)中加入0.4％的三氟乙酸,流速为1.5 ml/min,转速900r/min,检测波长为214 nm和280 nm,成功地从样品(B1组分)中分离得到两个F值大于20的区域D1区和D2区,F值分别为20.46和27.56。三、pH-区带精制逆流色谱分离制备高F值寡肽研究表明,在分离肽类物质时,在固定相中加入了一种特殊的亲和剂--二-(2-乙基己基)磷酸酯(DEHPA),可以增加固定相保留,提高峰的分离度。
研究确定pH-区带精制逆流色谱的分离优化条件为：150 mg样品(B1组分),溶剂体系为甲基叔丁基醚:正丁醇:乙腈:水=2:2:1:5(V:V:V:V),上相中加入20 mmol/L三乙胺和20％DEHPA后做为固定相,下相分成两部分,一部分加入10 mmol/L HCl后做为流动相I(MP1),另一部分加入20 mmol/L HCl后做为流动相II(MP2)。采用pH梯度洗脱的方式,流出液检测波长为214 nm和280 nm,流速和转速分别为1.5ml/min和900r/min。成功地分离纯化得到了5个高F值(F>20)的组分,估测其F值(F=OD214nm/OD280nm)高达24.7～36.4。HPLC肽谱分析显示,在酶解液中有三个高F值寡肽组分I、II和V,其F值分别为24.79、30.70和36.62。研究结果为进一步开展相关的研究积累了一些有价值的经验。