【摘 要】
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目的:研究PI3K/AKT信号通路在破骨细胞骨吸收上清(bone resorptionsupernatant，BRS)促成骨样细胞MC3T3-E1细胞分化-钙化过程中的作用;以及AKT2节点蛋白与MC3T3-E1细胞分行钙化
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目的:研究PI3K/AKT信号通路在破骨细胞骨吸收上清(bone resorptionsupernatant，BRS)促成骨样细胞MC3T3-E1细胞分化-钙化过程中的作用;以及AKT2节点蛋白与MC3T3-E1细胞分行钙化过程的关系。方法:采用前期实验收集的破骨细胞骨吸收上清(BRS)处理小鼠MC3T3-E1细胞，并加入不同浓度的特异性阻断剂LY294002(5μM，10μM，20μM)，蛋白免疫印迹实验(western-boltting)检测相关信号蛋白AKT, p-AKT的表达;酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测骨钙素(osteocalcin，OCN)表达水平;茜素红染色检测细胞外基质钙化水平。采用RNA干扰(RNA inference，RNAi)方法沉默MC3T3-E1细胞中AKT2基因，继而检测骨钙素表达及钙化水平改变。
结果:破骨细胞骨吸收上清BRS作用后MC3T3-E1细胞PI3K/AKT信号通路下游分子AKT及p-AKT表达显著增加(P＜0.05)。特异性抑制剂LY294002阻断后，P-AKT出现了剂量依赖性降低(P＜0.05)，AKT蛋白表达水平无明显差异。该结果证实LY294002成功阻断了PI3K/AKT信号通路。相应的骨钙素ELISA结果及茜素红染色结果显示LY294002阻断该信号通路后，骨钙素的表达和钙化结节的形成面积均被抑制，且为剂量依赖性降低(P＜0.05)。慢病毒干扰后，荧光显微镜观察及real-time PCR结果说明，细胞内AKT2基因被成功抑制;该基因被抑制后细胞骨钙素的分泌及钙化结节的产生受到了明显的降低。
结论:阻断剂LY294002能有效的阻断MC3T3-E1细胞的PI3K/AKT信号通路;PI3K/AKT信号通路在BRS促小鼠MC3T3-E1细胞分化-钙化过程中发挥重要的作用;应用pKLO.1-TRC-AKT2转染小鼠MC3T3-E1细胞能显著沉默AKT2表达。AKT2与MC3T3-E1细胞中与骨钙素分泌及细胞钙化结节形成相关。
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