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皮肤是人体最大的器官,完整的皮肤是机体抵御外界物理、化学损伤,生物等抗原物质的侵入、适应外界温度变化影响、防止水分过度丢失的机械屏障<[1]>,皮肤机械屏障功能的减弱是多种皮肤疾病发病的重要环节。如异位性皮炎,现认为皮肤的机械屏障异常是其发病和发展的重要原因之一<[2]>。从异位性皮炎的症状特点来看与中医的四弯风、湿疮、奶癣、顽湿等脾虚湿盛、湿郁化热的皮肤病相类似,健脾法是中医治疗异位性皮炎的重要治法,但至今尚未见到脾虚、健脾方药与异位性皮炎相关的药理研究报导,本研究以中医临床的证治规律为切入点,探讨脾虚与皮肤机械屏障功能的关系。
方法：
1.小鼠表皮脂质的抽提及表皮中神经酰胺含量测定方法研究抽提动物表皮脂质,采用薄层层析、BIO-RAD GelDoc凝胶成像系统采集图像、Quantity One软件分析测定神经酰胺含量,并对含量测定方法进行了方法学考察。
2.三种方法致小鼠脾虚对小鼠表皮神经酰胺含量的影响分别复制利血平、大黄、劳倦加饥饱失常三种方法致小鼠脾虚模型,测定表皮神经酰胺含量,以确定实验用脾虚模型。
3.皮肤机械屏障功能障碍瘙痒小鼠模型的考察用有机溶剂造成小鼠瘙痒模型,考察造模0天、3天、5天、7天小鼠瘙痒行为及表皮神经酰胺含量,以确定造模天数。
4.参苓白术散对皮肤机械屏障功能障碍瘙痒小鼠的作用复制小鼠瘙痒模型,观察参苓白术散对小鼠瘙痒行为的影响。
5.脾虚与皮肤机械屏障功能关系研究及参苓白术散对其干预作用分别复制利血平、大黄、劳倦加饥饱失常所致小鼠脾虚模型,并在此基础上复制小鼠皮肤机械屏障功能障碍瘙痒模型,采取预防性给予参苓白术散水煎液,记录动物两小时内瘙痒次数,测定神经酰胺含量,测量表皮厚度。
结果：
1.小鼠表皮脂质的抽提及表皮中神经酰胺含量测定方法研究方法学考察,得出:神经酰胺在0.416～2.08μg范围内,含量与密度积分值有良好线性关系,相关系数R=0.9953；同板精密度良好,RSD=1.09﹪；异板精密度良好,RSD=2.10﹪；对照品溶液与供试品溶液在2小时内显色稳定；重现性良好,RSD=3.03﹪；平均加样回收率为99.58﹪,RSD=1.46﹪；样品测定结果RSD=3.10﹪。
2.三种方法致小鼠脾虚对小鼠表皮神经酰胺含量的影响三种脾虚模型造模成功。模型组动物表皮神经酰胺含量较空白组均下降。其中,利血平组与空白组比较,p<0.001；劳倦组与空白组比较,P<0<0.05.大黄组与空白组比较,P=0.0606(接近0.05)。
3.皮肤机械屏障功能障碍瘙痒小鼠模型的考察造模5天动物与空白组动物比较,瘙痒行为最为明显,P<0.001；表皮神经酰胺含量降低最为明显,P<0.001。
4.参苓白术散对皮肤机械屏障功能障碍瘙痒小鼠的作用瘙痒次数和表皮神经酰胺含量,给药组与瘙痒组比较,均无统计学意义。
5.脾虚与皮肤机械屏障功能关系研究及参苓白术散对其干预作用(1)瘙痒行为脾虚瘙痒组动物瘙痒次数少于单纯瘙痒组动物.各给药组动物瘙痒次数均值小于相应脾虚组动物瘙痒次数均值。
(2)神经酰胺含量①利血平所致脾虚,各组均值:空白组>瘙痒组>给药组>利血平组,瘙痒组与空白组、利血平组与瘙痒组、给药组与利血平组比较,P<0.001；②大黄所致脾虚,各组均值：空白组>瘙痒组>给药组>大黄组,瘙痒组与空白组比较,P<0.001,大黄组与瘙痒组、给药组与大黄组比较,P<0.05:⑧劳倦所致脾虚,各组均值：空白组>瘙痒组>给药组>劳倦组,瘙痒组与空白组比较,P<0.001,劳倦组与瘙痒组、给药组与劳倦组比较,P<0.05。
(3)表皮厚度复制皮肤机械屏障功能障碍瘙痒模型后,表皮增厚,瘙痒组与空白组比较,P<0.001.利血平和大黄所致的脾虚能够加剧此种表皮增厚,两脾虚组与瘙痒组比较,均P<0.001,参苓白术散可明显抑制此种表皮增厚,给药组动物表皮厚度明显低于相应脾虚组,P<0.001。劳倦组动物表皮厚度小于瘙痒组,两组间差异无统计学意义,给药组与劳倦组间差异无统计学意义。
结论：
1.抽提动物表皮脂质、薄层层析、BIO-RAD GelDoc 凝胶成像系统采集图像及Quantity One软件分析的方法,可用于神经酰胺的含量测定。
2.三种脾虚模型均可作为实验用模型。
3.皮肤机械屏障功能障碍瘙痒小鼠模型的造模天数5天为宜。
4.参苓白术散对单纯瘙痒动物的瘙痒次数和表皮神经酰胺含量的影响无统计学意义。
5.皮肤机械屏障功能障碍时表皮神经酰胺含量降低,脾虚会加重神经酰胺含量的降低,健脾方药参苓白术散可以减轻脾虚小鼠瘙痒程度,提高神经酰胺含量,明显抑制利血平、大黄所致脾虚小鼠由于皮肤机械屏障功能障碍导致的皮肤增厚。
从本研究的结果可得出：利血平、大黄、劳倦加饥饱失常三种方法所致脾虚模型的表皮神经酰胺含量降低,皮肤机械屏障功能下降.该三种方法所致脾虚能够使已降低的皮肤机械屏障功能进一步降低,健脾方药参苓白术散能够在一定程度上改善之。