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性别控制技术在畜牧业中有重要的应用价值。哺乳动物Y染色体编码的基因大部分与性别发育有关。通过调控Y染色体基因的表达或功能将可能改变性别比例。本研究选取了Y染色体上的Dby基因作为靶基因,该基因的m RNA在成熟精子中和早期胚胎发育过程中均能够被检测到,暗示着该基因的功能可能与雄性胚胎的发育相关。我们利用RNA干扰的方法,研究下调小鼠早期胚胎中Dby基因的表达量对雄性胚胎发育及出生后雄性小鼠生殖能力的影响。针对Dby基因m RNA的编码区查找到4个靶位点,分别构建了表达shRNA的慢病毒载体,转染MC3T3-E1细胞系筛选出具有最佳抑制效果的shRNA1,其能够使细胞中Dby基因表达量显著下调至对照组的14%(P<0.05)。根据shRNA1序列设计合成siRNA,对小鼠受精卵进行雄原核显微注射,发现siRNA使体外培养至8细胞期的胚胎Dby基因表达量极显著下调至对照组的6.1%(P<0.01);注射抗Dby的siRNA对移植到受体母鼠体内的胚胎发育效率、性别比例没有显著影响,但是对雄性小鼠配种后的受胎率有显著影响(P<0.05),对雄性小鼠的睾丸发育也有一定的抑制作用。这表明在小鼠早期胚胎中利用RNA干扰技术能够有效地抑制Dby基因表达,但Dby基因表达量下调对雄性胚胎的发育没有影响,对出生后雄性小鼠的生殖能力会造成一定影响。同时,本研究选取了Y染色体上的多拷贝基因Rbmy为靶基因,利用CRISPR/Cas9系统特异性地切割Rbmy基因,研究其破坏Y染色体的可能性。我们针对Rbmy基因查找了6个靶位点,分别构建了相应的真核表达载体、原核表达载体及验证用靶载体。我们将Cas9、sgRNA及荧光报告靶载体共转染293T细胞系,通过检测细胞的荧光效率及荧光强度,比较CRISPR/Cas9系统在不同靶位点处的切割效率。本研究发现sgRNA6在293T细胞系上的切割效果最佳,其荧光效率达到52.64%,显著高于对照组,接近阳性对照的水平,且荧光强度最强。我们接着进行了sgRNA的体外转录,利用sgRNA在体外能够与Cas9蛋白结合形成核酸内切酶的特点,在体外检测了CRISPR/Cas9系统对靶序列的切割效率,发现sgRNA6对靶序列的切割效率几乎达到100%,与细胞水平上的结果一致,说明sgRNA6能够用于下一步对雄性胚胎Y染色体进行切割的研究。