目的：　　 1．对D2菌分泌的具有碱性蛋白酶活性的蛋白酶进行分离纯化，得到电泳纯的D2蛋白酶。　　 2．研究各种金属离子及洗衣剂对D2蛋白酶活性及稳定性的影响。　　 3．以D2蛋白酶为抗原，制备多克隆抗体，建立稳定的D2蛋白酶ELISA定量检测方法。　　 4．对D2蛋白酶进行氨基酸序列测定，测定其一级结构。　　 方法：　　 1．以D2菌48 h发酵液为材料，经低温离心机离心、冷冻机冻干浓缩、Superdex G-75凝胶过滤层析分离纯化D2胞外蛋白酶，用SDS-PAGE进行鉴定。　　 2．在纯化后的D2蛋白酶中加入Ca2?、Cu2?、Mg2?、K?等会属离子，通过酶活性前后的改变研究会属离子对该蛋白酶最适作用温度、最适作用pH值、酸碱稳定性和热稳定性的影响，在不同洗衣剂中加入D2蛋白酶，测定不同时间段该酶的活性。　　 3．以纯化后D2蛋白酶为抗原免疫家兔及豚鼠，制备多克隆抗体，建立检测D2蛋白酶的稳定的双抗体夹心ELISA及问接ELISA方法。　　 4．利用质谱仪Q-TOF对纯化后D2蛋白酶进行部分氨基酸序列测定。　　 结果：　　 1．发酵液经离心、冻干浓缩及Sephadex G-75纯化得到的D2蛋白酶，其纯化倍数为3.0，活性回收率为39.1％。　　 2．Ca2?、Cu2?、Mg2?、K?等金属离子对酶活力均有促进作用，5mM的CaCl?对D2蛋白酶的酶活性及稳定性具有显著激活作用，且该蛋白酶能在洗衣剂中稳定存在。　　 3．双抗体夹心ELISA方法中其包被抗体和捕获抗体的最佳包被效价分别为l：4000和1:5000，线性检测范围为(28～1180)ug g/L，检测限为4.6 u g/L，回收率为92.44％～105.26％，该方法检测结果与Bradford法检测结果具有良好的相关性；间接ELISA方法中线性检测范围为18～1160μg/L，与琼脂扩散试验检测结果的符合率为95.5％。　　 4．经Q-TOF质谱仪序列测定，得到六段氨基酸序列分别为QVAWATGETAAPK、FAVQSTFK、LGYVSPPALVLADDNAAAR、QLNLNVTQLGCGVFSGK、AHGFLPLTK、APSATGGSALYPLEFVVGK。　　 结论：　　 成功构建了可定量检测D2蛋白酶的ELISA方法，为后期该蛋白酶酶学性质及菌株生物学研究奠定了基础；D2蛋白酶氨基酸序列证明其为一类新型碱性蛋白酶，具有良好的工业应用前景，有望成为一种新型的海洋微生物蛋白酶资源。