丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)可以发酵产生丙酮(Acetone)、丁醇(Butanol)和乙醇(Ethanol)3种溶剂，是一种具有应用价值的工业菌株，该发酵过程亦被称为ABE发酵。丙酮丁醇梭菌对发酵原料的利用效率和产溶剂能力决定了ABE发酵的经济性，同时也成为受关注的研究热点。本论文主要围绕该菌株关键调控蛋白CcpA(catabolite control protein A)的功能展开研究，旨在深入认识CcpA对糖代谢及溶剂合成的调控机理，从而为菌株的代谢工程改造提供依据。　　木质纤维素被认为是一种廉价的、极具应用潜力的发酵原料，其水解后的糖组分可被微生物利用。由于丙酮丁醇梭菌的“碳分解代谢物阻遏效应(CCR)”抑制了其对木质纤维素水解液中复杂碳源的有效利用，因此，解除CCR是丙酮丁醇梭菌利用木质纤维素水解液发酵产溶剂的关键。前期研究已经证明CCR效应与CcpA蛋白密切相关。CcpA是存在于革兰氏阳性菌中的一个多效调控蛋白，但它在丙酮丁醇梭菌一这一重要的工业菌株中的作用如何，是否参与CCR和溶剂产生的调控过程，以及它的直接和间接的作用靶点有哪些等问题仍有待研究。　　本论文首先通过在枯草芽孢杆菌中的异源功能互补实验鉴定了丙酮丁醇梭菌中的CcpA蛋白。然后，采用Targetron技术对丙酮丁醇梭菌ccpA基因进行了中断失活，获得的突变株可同步利用葡萄糖和木糖，从而证明ccpA缺失可消除碳分解代谢物阻遏效应。通过控pH值的发酵，ccpA突变株利用3％葡萄糖和3％木糖(总浓度60 g/L)的混合碳源发酵可以产生的丙酮和丁醇浓度分别为4.94 g/L和12.05 g/L，该溶剂浓度接近野生型菌株以传统的淀粉质原料发酵产溶剂的水平。　　虽然ccpA失活后完全解除了丙酮丁醇梭菌的碳代谢物阻遏效应，但同时发现，突变株的产酸和产溶剂代谢也受到影响。如果在发酵过程中不调控pH，它将会累积过多的丁酸，不能从产酸期过渡到产溶剂期，在发酵培养基中仅产生少量的丙酮和丁醇。这个现象暗示，CcpA可能还调控了其他生理和生化过程。　　为了从总体上解析CcpA的调控功能，进行了全基因组转录谱分析。结果表明，CcpA不仅调控糖代谢，还与产孢、产酸和产溶剂等生理生化过程相关。在糖代谢方面，ccpA失活引起50％以上碳源转运与代谢基因的转录水平改变，这其中90％以上的基因为非速效碳源转运和代谢相关的基因。生物信息学分析发现，约70％受CcpA抑制的非速效碳源利用基因(操纵子)具有典型的CcpA结合位点(cre位点)。随后，通过凝胶阻滞(EMSA)实验证实，CcpA可以与含有典型cre位点的木酮糖激酶编码基因xylB和阿拉伯糖转运体编码基因araE1的启动子区结合，从而抑制它们的转录。这也证明了葡萄糖存在时是通过CcpA来抑制木糖和阿拉伯糖的代谢。上述结果证明了丙酮丁醇梭菌中大部分非速效碳源转运与代谢基因受到CcpA的直接调控。与此相反的是，ccpA失活引起葡萄糖利用速率的显著降低。转录分析结果表明，主要的葡萄糖PTS转运基因的转录下调，包括PTS EII组分编码基因glcG，CAC1353和CAC1354，以及PTS EI组分编码基因ptsI。因此，CcpA对葡萄糖转运可能具有正调控作用。　　在产酸产溶剂方面，ccpA失活引起丙酮丁醇梭菌多个产酸和产溶剂代谢基因的转录变化，包括产溶剂操纵子sol(adhE1-ctfA-ctfB)，丁酸激酶编码基因bukⅡ和产酸-产溶剂转换调控因子编码基因abrB。ccpA失活导致sol转录下调到野生型菌株表达水平的1/3。EMSA分析表明，CcpA可与sol的上游非编码区直接相互作用，从而起到转录激活作用。需要指出的是，sol上游非编码区中没有发现典型的cre位点，因此CcpA与sol的结合位点可能是非保守的。此外还发现，bukⅡ受到CcpA依赖的碳分解代谢物阻遏效应的调控。sol的转录下调和bukⅡ的转录上调可能是ccpA失活菌株高产丁酸以及产生酸崩溃的主要原因。此外，丙酮丁醇梭菌具有的3个序列高度相似的转录调控因子AbrB的编码基因在ccpA失活后发生不同程度的转录变化，同时我们在野生型菌株中发现这3个基因具有不一致的时序表达模式。因此我们推测这3个abrB基因可能具有不同的生理功能。　　此外，发现CcpA与丙酮丁醇梭菌产孢功能密切相关。突变株表现为产孢进程延缓和产孢率显著降低，仅为野生型的23％左右。经转录分析发现，多个产孢相关基因转录发生改变，如产孢途径特异性σ因子编码基因，包括sigE，sigG和sigK，以及受这些σ因子调控的结构基因。　　综上所述，丙酮丁醇梭菌的CcpA蛋白是一个重要的多效调控因子，它在主要调控糖代谢的同时也对菌株产孢和产溶剂等过程起着不可忽视的作用。