心脏发育过程十分复杂,人们在研究心脏病的发病机理过程中,对其中的一些难题已有了初步的解决方法和成效。但仍有许多问题亟待研究。通过鉴定心脏发育相关的调控因子,鉴定出与其相互作用的蛋白,发现其参与的信号通路,是研究基因功能的有效手段。阐明基因的分子调控机制将为研究清楚心脏发育的机制及心脏病的诊断等方面提供理论指导。本实验室前期已克隆出人和斑马鱼TMP3基因的DNA全长,证明TMP3是一个膜蛋白,在心脏中高表达,敲低斑马鱼TMP3基因导致心脏畸形。同时证明TMP3与转运蛋白TMPA4具有相互作用。通过分离膜、核、质蛋白的CO-IP实验,发现两者在细胞质和细胞核发生相互作用,提示TMP3蛋白入核,其入核过程可能需要转运蛋白TMPA4的协助。生物信息学分析表明,TMP3基因免疫印记编码的蛋白大小为35kd左右。我们通过免疫印记实验表明,TMP3蛋白大小约57kd。我们猜测,TMP3作为膜蛋白可能通过某些修饰作用而增加蛋白质的大小。我们取成体斑马鱼的心脏,分别提取细胞质、细胞核与细胞膜蛋白,检测TMP3蛋白的表达分布情况。结果表明,在细胞质和细胞膜中有35kd和57kd两种大小的TMP3蛋白,细胞核中的TMP3蛋白为57kd。实验结果显示TMP3在细胞质中的57kd条带背景较深,并且有拖带现象。经分析,可能是提取成体斑马鱼心脏蛋白过程中参杂有斑马鱼血液,去除血液后,背景及拖带现象明显消失,但在胞浆中并未显出TMP3蛋白。蛋白提取方法改良后,TMP3细胞质中有弱的57kd条带显出。有趣的是,分析结果发现,在57kd处细胞膜条带最亮,细胞核次之,细胞质最弱。而TMP表达出的35kd蛋白正好相反,即在细胞质表达最强,细胞膜中表达最弱。这说明TMP3蛋白分子量的增加是某种特异性修饰的体现。生物信息学分析发现,人类TMP3蛋白含有一个糖基化位点,我们构建了TMP3糖基化位点突变的质粒,转染H9C2细胞进行免疫印记分析,检测结果显示TMP3蛋白的大小依然是57kd, TMP3蛋白大小的变化与糖基化的关系正在研究中。研究表明,蛋白的SUMO化也与蛋白大小的变化有关,SUMO化修饰后的蛋白大小可增加到20kd或更大,故SUMO化修饰可能是我们研究的另一方向。TMP3蛋白SUMO化预测分析显示,TMP3蛋白序列可能含有一个到数个SUMO化的修饰位点。有关TMP3蛋白大小的变化与SUMO化的关系正在研究中。