研究背景:　　当今社会在高血压、糖尿病、高血脂、吸烟等动脉粥样硬化高危因素的作用下，成人外周动脉疾病在世界范围内的发病率约为3-10％，其中约有15-25％的PAD发生在＞70岁的患者中。而下肢动脉粥样硬化闭塞症(lower limbatherosclerosis obstruction，下肢ASO)这一种最常见的外周动脉疾病中，却仅有约20％的患者有间歇性跛行、静息痛等临床表现，而80％的患者却没有明显的临床表现。由于患者往往具有年龄高、下肢动脉血管病变解剖长度长、下肢动脉承受各种运动所致机械应力负担重等各种客观因素的影响，许多患者在进行腔内治疗或手术治疗后常反复发作。还有许多年长的下肢ASO患者治疗因不能耐受外科手术治疗以外而只能选择保守治疗，而且在严重下肢缺血患者中10％-30％患者于半年内死亡，25％-35％的患者将面临高位截肢。因此为了更好的解决下肢动脉粥样硬化患者下肢血运重建的这一难题，除了开发更有效的药物以外，学界10多年来一直在研究有效的基因疗法。　　2001年Shintani等通过对家兔单侧后肢缺血模型进行自体骨髓单个核细胞(Bone marrow derived mononuclear cells，BM-MNCs)移植研究发现，细胞移植组较对照组侧支血管形成及血管新生均有明显改善，表明BM-MNCs移植有助于缺血肢体模型的血管化。此后国内外相继开展自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血，并取得初步的疗效。谷涌泉等发现自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病的疗效与移植的干细胞总量密切相关，移植细胞量＜1105个/条下肢时无效或仅有微弱疗效，移植细胞量＞1108个/条下肢时，大多数患者是有效的。经过多年的研究，目前学界认为存在于外周循环及骨髓干细胞群中的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在血管新生、修复和维持血管内膜功能稳定的过程中起到了极其重要的作用。但EPCs在成年动物外周血中数量极少，有文献报导EPCs的细胞数仅占外周血细胞的0.0001％，这意味着循环血中的EPCs细胞数远远低于要达到有效缓解缺血症状所需的细胞数。并且，由于缺乏统一的分离方法与特异性的表面标志物和生物学特性，EPCs也难以在体外进行有效的分离和大规模扩增。　　除此之外目前学界主要认为EPCs促进新生血管形成的机制包括两个方面:一方面是通过自身的分化增殖而形成新生血管，无需依赖原来的血管系统;另一方面，EPCs本身可以分泌各种细胞生长因子，通过旁分泌及自分泌效应促进局部新生血管的形成，从而改善供血，而其中作用最强有力的成血管因子是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)。但是也有研究指出真正的EPCs是内皮集落形成细胞(endothelial colony forming cells，ECFCs)，但是因为目前分离和培养的各种技术条件限制导致ECFCs中混杂有血细胞来源的促血管生成细胞(pro-angiogenic cells，PACs)。ECFCs的主要作用是通过自身的分化增殖形成新生血管，而PACs的主要作用则是通过旁分泌及自分泌效应来促进局部新生血管的形成。然而对于EPCs具体的成血管功能以及其促新生血管形成功能的分子机制，学界仍知之甚少。　　因此，进一步研究EPCs生物学功能相关的分子机制将不但有利于提高人们对EPCs的分离、扩增EPCs效率;而且有助于提高EPCs自身的成血管能力;对EPCs移植治疗缺血性疾病的应用具有重要意义。　　研究目的:　　1、明确VEGF165基因质粒转染大鼠骨髓来源EPCs这一方法可行性，为提高EPCs的体外扩增效率及成血管能力提供新方法。　　2、进一步阐明EPCs成血管能力与VEGF165及其下游信号分子PLCγ之间的关联。　　3、为指导临床基因修饰干细胞移植治疗下肢慢性缺血工作奠定一定基础。　　实验方法:　　本实验首先通过用外源性VEGF165质粒转染大鼠骨髓来源内皮祖细胞(BM-EPCs)来提高BM-EPCs对VEGF165的表达，并通过检测转染外源性VEGF165质粒组、转染+PLCγ受体阻断剂组与未转染组细胞在体外成血管能力的改变，及各组中VEGF受体下游的PLCγ通路上各个信号分子表达水平的改变，以进一步从分子水平阐明EPCs的成血管能力与PLCγ信号通路之间的关联机制。　　实验结果:　　1.FITC-UEA-I染色阳性以及Dil-acLDL标记阳性率约为50％，证实诱导分化的细胞为EPCs。　　2.转染96h后，仅有约8-10％左右的BM-EPCs表达ZsGreen。　　3.脂质体法介导VEGF165质粒转染组BM-EPCs中VEGF165表达较未转染组增多，其VEGF165 mRNA也较未转染组增高。　　实验结论:　　BM-EPCs体外脂质体法转染外源性VEGF165质粒后可引起细胞内VEGF165mRNA浓度及VEGF165蛋白浓度的表达水平的增高，体外脂质体法转染BM-EPCs是可行的。但是体外脂质体法转染效率偏低，可能提示转染条件需要进一步改进。