病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是由病毒感染为起因，以心肌坏死及大量炎性细胞浸润为特征的感染性心脏疾病，好发于青壮年。发病率为10％~20%，近年来呈现上升趋势。病毒性心肌炎患者大部分病情发展为自限性，但其中约有10%~15%的病例由于病程迁延不愈，可使疾病从急性期转为慢性期甚至演变为扩张性心肌病（Dilated Cardial Myopathy，DCM）和充血性心衰，后两者成为心脏移植的首要指征，五年存活率仅为25%，目前尚无有效的治疗方法仍以预防为主。能引起病毒性心肌炎的病毒以柯萨奇病毒B组（coxsackie virus B，CVB）最为常见又尤以血清型3型（CVB3）致病性最强，其属于小RNA病毒科肠道病毒属。目前认为，CVB3诱导的病毒性心肌炎发病机制一方面是由于CVB3病毒对心肌的直接破坏作用，另外一方面是由于机体过强的免疫反应造成的间接损伤。　　以往研究通过调控适应性免疫应答如抑制Th1增强Th2，或者抑制Th17增强Treg细胞等，均发现在病毒性心肌炎中具有一定的保护效应。近年来研究显示病毒性心肌炎小鼠模型感染早期心脏中就有白细胞介素（interleukin，IL）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等炎症因子出现，并且中和炎症因子IL-1β可显著抑制心肌炎的发生。此外，心脏中浸润的炎性细胞主要是巨噬细胞达浸润细胞总数的40.6%，其次为T淋巴细胞占33.6%，上述研究均提示固有免疫应答在疾病早期即可影响炎症反应的进程和发展，对于调控后续适应性免疫应答的类型偏向及疾病发生发展具有决定性作用。然而目前对于病毒性心肌炎固有免疫应答的启动和维持机制尚不明确。炎性小体作为固有免疫的重要组成部分对IL-1β的成熟释放起着决定性作用。IL-1β在机体内是以未成熟的前体形式存在，炎性小体能够直接或者通过接头蛋白ASC（apoptosis-associated speck-like protein contain a CARD）募集半胱天冬蛋白酶的前体procaspase-1，形成一个蛋白质复合体进而调节caspase-1的活化，激活的caspase-1对IL-1β细胞因子前体pro-IL-1β进行切割加工，使其成熟并分泌到细胞外。目前发现NLRP1、NLRP3、NLRC4和AIM2可以形成炎性小体。其中研究最多并能感知RNA病毒炎症小体为NLRP3，NLRP3不仅可以识别PAMP，也可以识别机体本身细胞释放的危险相关分子模式（danger-associated molecular pattern，DAMP）分子，其识别谱十分广泛。由于能被多种类型的病原体或者危险信号所激活，NLRP3炎症小体在多种疾病过程中都发挥了关键作用，包括最初被确认的家族性寒冷性荨麻疹综合征(familial cold urticaria syndrome，FCUS)，随后发现的阿尔茨海默病、2型糖尿病和动脉粥样硬化等。　　因此，作为炎症反应的核心NLRP3是否能够感知CVB3，在VMC发病中的作用还不明确。因此我们重点研究了CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠模型中NLRP3通路的活化及其作用；并且对CVB3刺激引起NLRP3活化的分子机制进行了探讨。　　第一部分CVB3诱导的病毒性心肌炎中NLRP3通路显著活化　　病毒性心肌炎中细胞因子的产生有赖于机体对病毒的固有免疫识别，但在CVB3感染过程中是否会引起NLRP3的激活以及炎症小体的形成还不十分清楚。本部分研究我们通过腹腔注射CVB3（Nancy株）建立急性VMC小鼠模型，动态监测NLRP3及其炎症小体形成的情况，发现感染组小鼠出现体重持续下降，血清中心脏肌钙蛋白I（cardiac troponinI，cTnI）显著升高，心脏局部出现大量的炎症细胞浸润和坏死提示急性病毒性心肌炎小鼠模型成功建立，为下一步的机制研究奠定基础。我们发现CVB3感染小鼠IL-1β在转录和翻译水平均明显上调，并且与反映心肌炎病情严重程度的指标（体重减轻率及心脏炎症病理评分）均呈线密切正相关，提示IL-1β参与了CVB3诱导的病毒性心肌炎的发生发展。更为重要的是我们发现能够感知核酸RNA的炎症小体成分NLRP3表达显著上调及通路下游信号分子凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-1）的表达也显著上调，上述结果提示CVB3感染可以引起心脏局部NLRP3被激活，并通过ASC和caspase-1通路诱导IL-1β产生进而加重心肌炎。　　第二部分NLRP3通路在病毒性心肌炎中发挥重要致病作用　　在该部分中我们重点研究NLRP3通路在CVB3诱导的病毒性心肌炎发生发展中的作用。我们通过聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine，PEI）包裹质粒shRNA-NLRP3，并以脂质体复合物的形式尾静脉注射小鼠特异性下调体内 NLRP3分子来观察CVB3感染小鼠心肌炎病情的改变。经Western Blot证实感染第七天小鼠心脏和脾脏中NLRP3分子的表达量显著减少，下调效率分别达到约95%和92%，并于感染第七天检测小鼠心肌炎的严重程度。我们发现NLRP3下调组小鼠CVB3感染后心脏和血清中IL-1β的含量仅为339.8±7.781（pg/100mg）和111.0±16.28（pg/ml）较对照组528.0±15.32（pg/100mg）和467.7±6.562（pg/ml）显著下降；随后心脏病理学观察显示心脏炎症细胞浸润较对照组明显减少；体重下降情况也显著改善；同时NLRP3下调组的生存率由对照组的50%显著提高到80%。并且shRNA-NLRP3组较空载组心脏收缩功能明显增强，主要表现为左心室射血分数（ejection fraction，EF）为76.98±1.660（%）高于对照组20.54±1.740（%），左室短轴收缩率（fraction shortening，FS）44.40±1.266（%）较对照组19.34±0.9161（%）显著升高。上述结果显示下调NLRP3可显著减轻CVB3诱导的病毒性心肌炎的病情，提示NLRP3通路可通过促进炎症因子IL-1β加重心脏局部炎性细胞浸润及心肌坏死，在病毒性心肌炎的发生发展中扮演着重要的致病作用。　　第三部分CVB3刺激可显著活化巨噬细胞NLRP3通路　　病毒性心肌炎患者及 CVB3感染小鼠模型的心肌组织中均存在大量单个核细胞浸润，其中以巨噬细胞为主（占浸润白细胞50%以上），并且巨噬细胞主要聚集于损伤部位，提示与心肌细胞损伤关系密切。同时我们前期研究发现巨噬细胞可以通过分泌大量的促炎因子IL-1β、TNF-α等参与病毒性心肌炎的发生发展，NLRP3作为重要的免疫分子是否参与巨噬细胞的促炎表型和维持尚不清楚，因此本部分我们主要研究病毒性心肌炎中巨噬细胞NLRP3活化情况。我们首先检测了CVB3诱导病毒性心肌炎小鼠心脏局部能形成炎性小体 NOD家族成员 NLRP1、NLRP3和NLRC4 mRNA水平，结果显示仅NLRP3表达升高。然后我们进一步在体外直接用CVB3刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞，结果也仅见NLRP3 mRNA的水平上升且上调呈现与 CVB3刺激剂量和刺激时间的依赖性。而当下调 RAW264.7巨噬细胞NLRP3分子后，CVB3刺激产生IL-1β的能力显著降低。随后我们在小鼠原代腹腔巨噬细胞及骨髓来源的巨噬细胞中进一步验证了上述现象，我们同样发现CVB3刺激后可以上调原代巨噬细胞NLRP3的mRNA表达促进IL-1β的生成。通过上述体内外实验我们发现通过 CVB3可以活化巨噬细胞 NLRP3通路并促进IL-1β的产生，然而其具体机制尚不明确。　　第四部分CVB3活化巨噬细胞NLRP3通路的机制探讨　　通过上述研究我们发现 CVB3刺激可以活化巨噬细胞 NLRP3通路并促进IL-1β的产生，在该部分中我们主要探讨了CVB3活化巨噬细胞NLRP3通路的具体机制。首先我们通过免疫荧光的方法发现 CVB3可以进入巨噬细胞的胞质，并与NLRP3分子共定位，提示NLRP3可能参与CVB3病毒的感知。然而当我们以Real-Time PCR的方法检测病毒在巨噬细胞中的复制情况时发现病毒正链和负链的数量均无变化，提示该病毒并不能在巨噬细胞中有效复制。此外当我们用基因中含有GFP的CVB3（CVB3-GFP）来刺激巨噬细胞时，胞内并未检测到带有GFP蛋白的病毒颗粒，上述结果均提示CVB3并不能在巨噬细胞中进行有效转录扩增。由此也提示我们只有在复制过程中产生的分子并不为NLRP3所感知，而有可能感知的是病毒结构成分。为了证实这一想法我们随后用野生型和热灭活的 CVB3分别作用于RAW264.7细胞，结果发现两者同样能使NLRP3激活由此提示CVB3的组成可以激活NLRP3。为进一步确定到底是哪一结构组成活化了NLRP3，我们分别检测了CVB3的基因组RNA以及病毒合成的相关蛋白VP0，VP1，3AB，3CD，结果发现其中只有VP1可以显著上调NLRP3分子的表达，表明CVB3可以通过VP1蛋白活化巨噬细胞NLRP3通路。　　综上所述我们发现NLRP3分子在病毒性心肌炎中显著上调表达，并在心肌炎的发生发展过程中发挥重要的致病作用。进一步研究发现CVB3病毒可以通过VP1蛋白活化巨噬细胞NLRP3通路，并通过分泌大量的IL-1β加重心肌炎病情。本研究不仅为VMC的发病机制提供了一个基于固有免疫调控的新视角和认识，同时为疾病的防治提供了针对固有免疫的巨噬细胞及NLRP3活化调控的新靶点。