论文部分内容阅读
目的 鼻咽癌是我国常见的头颈部恶性肿瘤之一;尤其广东地区较为高发;具有种族遗传性和地域聚集性;严重威胁我国人民的生命和健康;由于鼻咽部解剖结构限制及常规化疗药物不敏感;放射治疗成为目前鼻咽癌的主要治疗手段。近十几年来;随着放射治疗技术的发展;使鼻咽癌的治疗效果得到一定程度的提高。尽管放疗设备和方法不断改进;比如立体定向放疗、三维适形放疗、调强放疗等;但是;在临床上我们仍然发现部分患者的预后很差;放疗结束后不久便发生复发转移;对放射线抵抗或者放疗后逐渐出现放疗抵抗是其治疗失败的主要原因。临床上我们也发现具有相同肿瘤的不同个体对治疗的反应是不一样的;相同病理类型的肿瘤和同样的临床分期;在接受同样的治疗方案时;不同个体也出现明显的疗效差异。因此;放射抵抗是鼻咽癌治疗的主要障碍之一。阐明鼻咽癌放射抵抗的潜在分子机制;寻找预测鼻咽癌放射抵抗的分子指标; 对患者实施个体化治疗方案;具有重要的理论意义和现实意义。 方法 1) 选用对放射线较敏感的鼻咽癌低分化鳞癌细胞株 CNE2;采用梯度增加放射剂量的方法建立放射抵抗细胞株CNE2-RR。 2) 通过平板克隆、细胞周期、细胞凋亡、细胞增殖及彗星实验检测CNE2-RR细胞的放射抵抗特性。 3) 采用 QRT-PCR 技术检测同源重组相关基因在放射抵抗细胞株CNE2-RR和放射敏感细胞CNE2中的差异表达;并采用Western blot验证。 4) 免疫荧光技术观察同源重组相关蛋白聚集点在电离辐射前后的变化。 结果 1) 成功建立了放射抵抗细胞株CNE2-RR:（1）平板克隆实验结果发现; CNE2-RR 细胞较对照组 CNE2 细胞的存活克隆更大、数目更多。多靶单击模型拟合的剂量存活曲线显示;与放射敏感CNE2细胞相比;CNE2-RR 细胞的剂量存活分数曲线下降趋势较慢;说明诱导建立的耐放射细胞株的具有一定程度的放射抗拒性;其放射抵抗性具有一定的稳定遗传能力。（2）MTS细胞增殖实验表明;电离辐射后;放射抵抗CNE2-RR细胞的增殖能力明显高于对照组CNE2细胞。（3）细胞周期结果显示;放射线照射后;抗拒细胞 CNE2-RR在G2/M期细胞的比例明显低于CNE2细胞;而S期细胞百分率明显高于CNE2细胞;而且CNE2-RR细胞在M期的细胞比例亦明显低于CNE2细胞;说明放射抵抗细胞株CNE2-RR较CNE2细胞的放射敏感性降低了。（4）流式凋亡检测结果显示;随着电离辐射照射剂量的增加;各组细胞的凋亡率也逐渐升高;但在相同照射剂量下;放射敏感细胞CNE2的凋亡率明显高于放射抵抗细胞CNE2-RR;表明在相同照射剂量的下;放射抵抗细胞株 CNE2-RR 对放射线更加抗拒;进一步证明了建立的 CNE2-RR 具有放射抵抗性。（5）彗星实验结果显示;电离辐射处理后30min;各组细胞核明显形成彗星尾;呈现出头大、尾细长的彗星特征;而在照射后6h;两组细胞的彗星尾明显缩短;说明CNE2-RR和CNE2细胞均具有一定程度的修复能力;但是在30min及6h;CNE2-RR细胞的尾距均较CNE2细胞短;差异有统计学意义(P<0.05);说明CNE2-RR细胞在抵抗放射线及DNA损伤修复能力方面均强于CNE2细胞。 2) HR 相关蛋白在放射抵抗细胞株 CNE2-RR 和放射敏感细胞 CNE2中的差异表达：（1）QRT-PCR结果显示HR相关基因（NFBD1、RAD51、BRCA1、BRCA2、RPA1）在CNE2细胞中的表达明显低于CNE1和HNE1细胞;而在放射抵抗细胞CNE2-RR中;HR相关基因的表达明显高于放射敏感细胞 CNE2。（2）并采用 Western blot技术验证了HR相关蛋白NFBD1、RAD51、BRCA1、BRCA2、RPA1的表达;与放射敏感CNE2细胞相比;均在CNE2-RR细胞中高表达;与QRT-PCR结果一致;说明HR修复通路可能参与了鼻咽癌细胞的放射抵抗形成。（3）进一步采用免疫荧光技术观察γ-H2AX及HR相关蛋白NFBD1、RAD51、BRCA1、BRCA2、RPA1在电离辐射前后聚集点的形成;结果显示;电离辐射明显促进了γ-H2AX 聚集点的形成;但在 CNE2-RR 细胞中的γ -H2AX 聚集点较CNE2细胞明显少;说明CNE2-RR对放射线的抵抗能力明显高于CNE2细胞;同时;电离辐射也明显促进了NFBD1、RAD51、BRCA1、BRCA2、RPA1聚集点的形成;但在CNE2-RR细胞中的NFBD1、RAD51、BRCA1、BRCA2、RPA1聚集点均较CNE2细胞多;说明CNE2-RR细胞的HR修复能力明显高于CNE2细胞。因此; HR 修复通路参与了鼻咽癌细胞放射抵抗的形成;使CNE2-RR细胞具有抵抗放射线诱导DNA损伤和增强其DNA损伤修复的能力。 结论 1) 采用梯度增加照射剂量的方法;成功建立了鼻咽癌放射抵抗细胞株CNE2-RR;并通过检测其放射相关的生物学特性;证明了诱导的CNE2-RR细胞具有一定程度的放射抵抗性; 2) HR 相关蛋白在放射抵抗细胞 CNE2-RR 中的表达明显高于 CNE2细胞;说明HR修复通路参与了鼻咽癌细胞的放射抵抗形成; 3) 放射抵抗细胞CNE2-RR具有较强的抵抗放射线诱导DNA损伤和损伤修复的能力。