枸杞遗传转化体系建立及FT转基因植株的获得

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黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)和宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)同属茄科枸杞属多年生浆果类灌木,是我国传统的名贵中药材,具有十分重要的药用价值。  本课题首先通过挖掘黑果枸杞和宁夏枸杞的转录组数据克隆获得其开花关键基因FT(Flowering Locus T),分别命名为LrFT和LbFT,通过生物信息学方法分析两个蛋白质的氨基酸序列、功能域及其系统发育关系等;并通过实时定量PCR分析其在两种枸杞不同组织中的表达模式。研究结果表明:LrFT和LbFT均编码一个由173个氨基酸组成的蛋白质。蛋白序列分析表明:LrFT和LbFT序列相似度达98%,具有保守的PEBP(phosphatidylethanolamine-binding protein)结构域。系统进化分析表明:LrFT和LbFT与茄科植物番茄、烟草和马铃薯的FT亲缘关系较近。基因表达结果表明:LrFT和LbFT主要在叶片中表达,且在两种枸杞的叶片中表达量有一定的差异。  其次,以黑果枸杞和宁夏枸杞(‘宁杞4号’)为研究对象,选用叶片和下胚轴作外植体,重点考察NAA、6-BA和IBA三种激素对外植体的愈伤诱导及分化能力的影响。通过一系列不同处理,成功获得黑果枸杞叶片外植体高效离体再生体系及转化体系,转化了过量表达的水稻的FT基因,并获得早开花转基因植株,其中重要的培养有三种:(1)愈伤诱导培养基:MS+IBA1.0 mg/L+6-BA1.0 mg/L+CB500mg/L+HygB50mg/L;(2)分化培养基:MS+ CB500 mg/L+HygB25 mg/L;(3)生根培养基:1/2MS+CB500 mg/L+HygB25 mg/L。获得的抗性株系经PCR分子检测,发现目的基因已成功转入黑果枸杞中。对于宁夏枸杞虽然获得其下胚轴外植体稳定高效离体再生体系,但是目前还没获得其转基因植株;其中重要的培养基也有三种:(1)愈伤诱导培养基:MS+2,4-D0.2 mg/L;(2)分化培养基:MS+6-BA0.2 mg/L;(3)生根培养基:MS基本培养基;其再生率达83%。  本研究为后续枸杞相关功能基因的挖掘及功能基因的验证提供一个非常好的技术平台。此外,采用植物基因工程的手段培育新的枸杞品种,不仅可以避免传统育种方法存在的周期长、效率低等问题,而且可以打破物种之间的界限,实现枸杞遗传性状的定向改良,为枸杞种质资源的开发利用提供技术支持。此外,也可以为其他物种的转基因研究提供一定的借鉴。
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