研究背景体内肿瘤细胞生长快速,代谢方式以糖酵解为主,产生大量乳酸,并且肿瘤细胞高表达钠氢转运蛋白1(Na+-H+exchanger-1,NHE-1)使H+外排增多,再加上肿瘤组织循环灌流相对不足,最终营造了肿瘤局部胞内偏碱、胞外偏酸的微环境。众多研究表明,酸性微环境可促进肿瘤细胞的恶性转化与耐药,但是目前关于此方面研究大多局限于表型的观察,且采用的模型多为短期的急性酸应激。长期酸应激下肿瘤细胞的增殖变化,以及肿瘤细胞胞内pH(pHi),NHE1表达特点还不明确。细胞上皮间充质转化(EMT)是肿瘤细胞恶性转化的主要表型之一,发生EMT后,细胞迁移和侵袭能力增强,EMT被认为是肿瘤获得转移能力的重要原因。很多研究表明短期酸性应激时,肿瘤细胞会发生EMT。细胞间充质上皮转化(MET)是EMT的逆向过程,常发生在肿瘤细胞远处转移后克隆形成阶段,与肿瘤快速增殖有关。但是目前关于EMT、MET与酸性环境下肿瘤增殖的相互关系还不明确。Cdc6和Mcm7是DNA复制前复合体(pre-replication complex,pre-RC)的重要成员,其主要功能是起始细胞DNA复制。近年来研究发现,Cdc6、Mcm7蛋白可作为表观遗传调控因子,广泛参与胞内事件,会促进肿瘤细胞恶性转化。但是目前关于Cdc6、Mcm7在酸性环境中对肿瘤细胞增殖的作用未见有报道。研究目的1、明确长期酸应激对肿瘤细胞EMT表型、pHi和增殖的影响;2、明确pre-RC蛋白CDC6、MCM7在长期酸应激中肿瘤细胞增殖的作用。研究方法和结果1.酸应激诱导肿瘤细胞发生EMT:酸应激(Panc1、HepG2:pH6.8;UMUC3:pH6.5)24h后,qPCR检测到EMT相关基因E-cadherin下调及Vimentin上调,并且酸性环境使肿瘤细胞对顺铂药物耐受增强;肿瘤细胞经过酸性培养7天后EMT相关蛋白Vimicntin明显上调,干性基因表达显著上调。2.酸应激诱导肿瘤细胞进入静止期且pHi降低:酸诱导7天使肿瘤细胞增殖减慢并进入静止期;静止期肿瘤细胞NHE1表达下调,BCECF-AM荧光探针检测发现静止期肿瘤细胞pHi降低。3.长期酸性诱导肿瘤细胞发生MET并获得酸适应肿瘤细胞:酸性培养HepG2和UMUC3细胞2个月后细胞重新获得增殖能力成为酸适应肿瘤细胞;酸适应肿瘤细胞N-cadherin和Vimentin蛋白表达降低,说明细胞发生了MET转化;酸适细胞中NHE1蛋白表达升高,pHi恢复到正常细胞水平。而Panc1细胞不能获得酸适应细胞。4.MCM7促进酸适应肿瘤细胞增殖,并帮助维持MET表型:酸适应肿瘤细胞表现出独特的增殖特征,其E2F1(G1-S重要转录因子)蛋白水平没有恢复,而MCM7表达恢复,与细胞增殖状态相符。干扰MCM7可抑制酸适应肿瘤细胞增殖,下调Cyclin D1和Cyclin E1蛋白表达,并促进Vimentin蛋白表达。辛伐他汀(MCM7抑制剂)同样可显著抑制酸适应肿瘤细胞增殖。相反,MCM7稳定过表达促进了 HepG2细胞在酸性环境中增殖,并抑制了酸性诱导的EMT转化。研究结论1.长期酸应激使肿瘤细胞发生EMT-MET表型转换;2.细胞EMT-MET表型转换与增殖状态相关,静止状态细胞多为间质表型,增殖状态细胞多为上皮表型3.酸适应肿瘤细胞表现出独特的增殖特性,MCM7促进肿瘤细胞在酸性环境中增殖,并且与EMT和MET表型转换有关;