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帕金森病(Parkinsonsdisease，PD)是一种中老年人常见的神经系统变性疾病，病理上主要表现为黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元的丢失死亡及路易小体形成。目前，对于胶质细胞对DA能神经元的双重作用的具体机制尚有待于进一步阐明。本研究利用蛋白质组学技术的优势，采用SILAC、DIGE、生物质谱等多种先进的蛋白质组学方法，对与胶质细胞对DA能神经元双重作用相关的蛋白进行了较大规模的筛选。并进一步结合功能学方法，对蛋白质组学的结果进行了分析和验证。
本课题共分为两个部分：(一)对于胶质细胞毒性作用的研究：主要关注小胶质细胞在致炎因子脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激早期的反应。(二)对于胶质细胞保护性作用的研究：主要关注胶质细胞所释放GDNF可能的下游信号分子。
第一部分：蛋白质组学研究揭示小胶质细胞在炎性刺激早期大量分泌溶酶体相关蛋白
LPS是一种强大的致炎因子、小胶质细胞激活剂，被广泛应用于研究小胶质细胞在帕金森病等神经变性性疾病中的作用。由于对于在致炎因素作用下小胶质细胞的早期反应目前仍然知之甚少。因此，本研究致力于用蛋白质组学的方法揭示胶质细胞在LPS炎性刺激早期分泌蛋白的特征性变化。
1.蛋白质组学研究：小胶质细胞在脂多糖(LPS)刺激早期分泌蛋白的差异表达(1)取SpragueDawley大鼠全脑进行小胶质细胞原代培养及纯化，纯度＞98％；(2)利用WesemBlot及ELISA的方法检测了小胶质细胞在LPS刺激下表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、前列腺素E2(PGE2)及其合成酶环氧化酶.2(COX-2)的时间效应关系，显示iNOS在LPS刺激后3小时表达，PGE2和COX-2在LPS刺激后24小时表达明显。(3)选择LPS刺激1小时为时间点，利用SILAC方法在细胞培养阶段对蛋白进行同位素标记，质谱液相色谱-电喷雾-串联质谱进行蛋白的鉴定及定量比较LPS刺激组和正常对照组两组细胞培养基中分泌蛋白表达的差异。共有155个蛋白被成功鉴定。(4)利用生物信息学分析软件SignalP以及GenomeOntology数据库检索对所鉴定蛋白进行亚细胞定位及生物学功能分类。结果显示，有77个蛋白符合分泌蛋白标准，其中，28个蛋白与溶酶体相关，13个溶酶体相关的蛋白的分泌水平在LPS刺激下发生了明显的变化。
2.功能学研究：LPS刺激下小胶质细胞大量释放的溶酶体相关蛋白对多巴胺能神经元的毒性作用(1)利用WesternBlot的方法对蛋白质组学的结果进行验证，均与蛋白质组学结果相吻合。(2)利用共聚焦的方法观察了cathepsinL与溶酶体标志蛋白LAMP-1的共定位情况，这两种蛋白在胞浆中的分布是共定位的，说明在分泌蛋白中所检测到的cathepsinL的确来源于小胶质细胞溶酶体。(3)利用ELISA的方法检测了溶菌酶(lysozyme)的活力，相对于对照组而言经LPS处理1小时的小胶质细胞培养基中，该酶活力明显上升。(4)检测了小胶质细胞培养条件下20Schyrnotrypsin蛋白酶和postglutamyl蛋白酶的活力，此两种酶的活力在LPS处理的情况下相对于对照组，均未发生明显改变。(5)检测MES23.5细胞酪氨酸羟化酶蛋白丰度及多巴胺摄取能力，反映条件培养基作用下DA能神经元的功能。结果显示LPS刺激早期的小胶质细胞培养基对DA能神经元有毒性作用，溶酶体抑制剂NH4Cl可以明显抑制该神经毒性。
结论：小胶质细胞在LPS刺激早期大量释放溶酶体相关蛋白，这些蛋白的早期释放参与了小胶质细胞对DA能神经元的毒性作用。因此，本研究筛选出大量与小胶质细胞炎症反应相关的蛋白，从而为下一步PD发病机制探索及临床药物筛选提供了线索；除此之外，本研究从全新的视角提出了小胶质细胞参与PD等神经变性性疾病发生过程的可能机制。
第二部分：磷酸化修饰的蛋白质组学研究揭示胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)下游信号分子
GNDF是由胶质细胞分泌的一种神经营养因子，被认为是胶质细胞对神经元发挥保护作用最主要的途径。它对DA能神经元的神经保护及促生长作用尤其明显，被认为是神经保护治疗PD的首选神经营养因子。然而对于GDNF信号转导的具体机制尚不完全清楚，因此，本研究致力于用蛋白质组学的方法寻找参与GDNF信号转导通路的可能的信号分子。
1.蛋白质组学研究：PC12细胞在GDNF刺激下发生调变的磷酸化蛋白谱(1)观察GDNF所引发的双转GFRαl和RET的PC12细胞轴突生长作用，200ng/mlGDNF刺激12小时以内，无明显的轴突生长；(2)取GDNF处理0.5小时和10小时作为时间点，利用DIGE方法对所纯化的磷酸化蛋白进行标记，双向电泳-串联质谱进行蛋白的鉴定及定量比较GDNF刺激组和正常对照组两组细胞磷酸化蛋白表达的差异，串联质谱进行差异蛋白的鉴定。125差异点中，共有92个点被成功鉴定。(3)利用生物信息学分析软件Cluster和Treeview对所获得差异蛋白进行丛集性分析，用生物信息学GenomeOntology数据库检索对所鉴定蛋白进行亚细胞定位及生物学功能分类。结果显示，共有75个点的蛋白在GDNF处理的两个时间点上均发生了上调(鉴定出来58个点，代表47个基因)，大部分蛋白(74.1％)具有“捆绑”(binding)的功能，部分蛋白具有水解酶活力(20.4％)。
2.功能学研究：小热休克蛋白27(hsp27)的磷酸化参与GDNF引起的轴突生长(1)利甩WesternBlot及RT-PCR的方法对蛋白质组学的结果进行验证，结果显示，在GDNF刺激下，PC12双转细胞的Hsp27总蛋白表达水平不变，磷酸化蛋白水平有所上调，与蛋白质组学结果一致；(2)利用共聚焦显微镜技术及WesternBlot观察，在GDNF刺激下，Hsp27迅速发生核内转位，24小时复位至胞浆，此过程伴随着核内磷酸化Hsp27的明显上调。(3)构建了联合表达绿色荧光蛋白GFP的RNAi干扰质粒，对PC12双转细胞的Hsp27成功干扰后，GDNF引起的轴突生长作用明显受到抑制。(4)构建了联合表达绿色荧光蛋白GFP的野生型及特异性磷酸化位点定点突变的Hsp27质粒，结果表明，显性负向突变可使GDNF引起的轴突生长作用受到部分抑制。
结论：利用先进的定量蛋白质组学技术，成功鉴定出多个可能GDNF信号通路有关的磷酸化蛋白，对于这些新的蛋白的研究将有助于进一步揭示GDNF信号转导通路的下游分子，并为帕金森病的治疗提供了进一步筛选靶蛋白的依据。在此基础上，利用多种方法率先证明了其中的一个新的信号分子Hsp27参与了GDNF所引起的DA能细胞分化过程。