柑橘是热带、亚热带最重要的果树之一,具有重要的经济价值。随着科技的发展,人们越来越认识到种质资源保存的重要性。离体种质保存成为柑桔种质保存的有效手段而受到国内外的重视。本试验主要开展如下研究:①以芦柑珠心胚试管苗为材料,进行了离体保存体系的优化;②67份柑橘种质珠心胚试管苗的离体保存;③柑桔试管苗叶片GPX基因的克隆;④柑桔离体保存试管苗叶片microRNA的分离与鉴定,旨在保存柑桔种质资源,并为研究其离体保存分子机制奠定基础。主要研究结果如下:1.芦柑试管苗保存体系的优化以初代培养一个月的芦柑试管苗为主试材料,将其茎段切成1.5-2 cm,每一段包括一个健壮的节,采用L9（34）正交设计实验,探讨基本培养基、多效唑浓度和甘露醇浓度对芦柑试管苗保存的影响,筛选出最佳培养基。结果表明:1/2MS+1.0 mg·L^-1多效唑+1.0 g·L^-1甘露醇最有利于芦柑试管苗的保存,其次为1/4MS+1.0 mg·L^-1多效唑+5.0 g·L^-1甘露醇,而MS+1.0 mg·L^-1多效唑+10 g·L^-1甘露醇最不利于芦柑试管苗的保存。在探讨的这三个因素中,甘露醇浓度对芦柑试管苗保存的影响程度最大,而多效唑和基本培养基则效果相当。当甘露醇浓度为10 g·L^-1时对芦柑试管苗保存不利,而多效唑浓度为1.0 mg·L^-1时则有利于其保存,适当的营养饥饿有利于保存。2. 67份柑桔种质资源的试管苗离体保存本研究在继续保存原有43份柑橘种质资源的同时,新增资源24份,分别为红桔、柠檬橙（平顶）、柠檬橙（凸顶）、立花桔、琼中绿橙、本地早、芦芝柚、四季柚、早3号、野生桔、血橙、脐橙、金弹1、金弹2、金弹3、滑皮金柑、金柑35B、金柑58B、金柑59、金柑59B、金柑72B、金柑80B、金柑101B和金柑105。在接种一个月后对新增加的24份资源中的18份的生长情况进行了观察,结果发现除金弹1和滑皮金柑外,其它柑橘徒长严重,且顶端优势明显;立花桔、柠檬橙、台湾红桔等10份资源叶片充分展开,其它8份资源叶片未充分展开,叶片大小差异较大;根均生长健壮,但长度各异,差异较大。3芦柑试管苗GPX基因的克隆以芦柑试管苗的叶片为材料,采用改良的Trizol法提取总RNA,采用同源克隆的方法对芦柑试管苗GPX基因进行克隆。保守区引物直接采用陈义挺（2009）在龙眼上设计的GPX保守区引物,通过RT-PCR扩增出保守区序列,长度为387 bp（包含上下游引物）,与已登录NCBI的多种植物的GPX基因同源性较高,其中与蓖麻的同源性最高,达86%;根据已经获得的GPX基因保守区序列设计3’RACE引物,经过两轮巢氏PCR扩增,得到3’端序列,长度为500 bp;采用DNAMAN 6.0软件将得到的保守区和3’端的序列进行拼接,得到一条599 bp长的片段。已在GenBank上登录,登录号为:GU130596.1。4利用Solexa测序技术鉴定柑橘试管苗叶片中的miRNAs本研究第一次对柑橘试管苗叶片进行小RNA文库构建和Solexa测序。以芦柑试管苗叶片发育过程中的三个时期的叶片为材料,提取小分子RNA,将其均匀混合,进行小RNA文库构建和Solexa测序。研究结果表明:共得到Unique序列3,065,625条,其中miRNA占0.68%;10.44%的Unique序列能在柑橘基因组中找到匹配位点;柑橘sRNA以24 nt的长度作为主要存在方式;柑橘试管苗叶片发育过程中Unique sRNA的表达丰度存在巨大差异,从一次到数万次不等,其中大部分为低丰度表达;总共鉴定了302个已知的柑橘miRNA,构成117个家族,不同家族间成员数量存在巨大差异;保守miRNA长度集中在21 nt;双子叶植物特有的miR163在本研究中未检测到,而被认为是单子叶植物所特有的miRNA437/ 444/528/1122/1126/1132在本研究中得到发现;另外总共获得76个候选的miRNA,其中有28个miRNA含单个基因座,另48个miRNA具备多个基因座;76个候选miRNA中有72个预测到了靶基因,总共对应着约153个基因符合靶标特征。