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生殖细胞系是两性配子生成和种族延续的基础。作为生殖细胞的祖先,原始生殖细胞(PGCs)会经历特定迁移,增殖,并分化为雌雄性原细胞。在模式及少数淡水鱼类中发现,性原细胞增殖数量决定雌雄性别分化方向。然而目前鱼类性原细胞增殖相关的规律及机制却仍不清楚,并缺乏相关海水鱼类的研究。牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国重要的海水养殖经济鱼类,具有XX/XY性别决定机制。养殖过程中,牙鲆雌鱼较雄鱼生长快,个体大,且其性别决定受到环境因素的影响。因此本研究采用雄激素(17α-甲基睾酮),高温(27.5±0.5℃),雌激素(17β-雌二醇)及对照(18°C±0.5°C)处理XX牙鲆幼鱼,并分别获得4组雌雄主导群体,性别比率分别为雄93%,雄95.24%,雌99%和雌95%。我们以生殖细胞为研究主体,分析了雌雄生殖细胞增殖分化的基本规律;并进一步分析了性分化过程中,gsdf,amh和p450arom三个基因在雌雄主导群体中的表达及其对生殖细胞增殖的调控机制。首先我们以牙鲆雌雄主导群体为研究对象,详尽系统地描述了生殖细胞迁移,增殖和分化的基本规律。孵化后,牙鲆PGCs经历特定胚后迁移,于15dph迁移至性腺原基,并于22dph由性腺体细胞包绕PGCs共同形成原始性腺;35dph,性原细胞进入第一次有丝分裂慢速增殖时期,同时基底膜形成以维持性原细胞自我更新的微环境;52dph,雄性性原细胞持续慢速增殖,呈单个独立分布,而雌性性原细胞进入第二次有丝分裂快速时期,形成2细胞生殖囊,且其生殖细胞数量是雄性的1.5倍,至66dph,雌性生殖细胞增加为雄性的2倍;73dph,雄性性原细胞持续慢速增殖,雌性性腺中传统卵巢分化的标志-卵巢腔和生殖上皮开始形成;85dph,雄性性原细胞进入第二次有丝分裂快速增殖时期,生殖细胞数量呈指数增长,2-8个雄性性原细胞形成一个由基底膜包绕界定的腺泡状细胞团,同时传统精巢分化的标志-输精管原基形成,而卵巢中卵母细胞开始进入第一次减数分裂的胞核改变期;120dph,雄性性原细胞团中精原干细胞开始分化为B型精原细胞,丢失干细胞标记基因Nanos2的表达,并发育为精小叶的结构。然后我们克隆得到牙鲆gsdf基因,通过RT-PCR发现gsdf在性腺组织中特异表达。通过原位杂交和免疫组化发现,性腺发育过程中gsdf mRNA和蛋白均特异地表达于生殖干细胞即性原细胞,精原细胞和卵原细胞周围的性腺体细胞。进一步敲降和过表达XX牙鲆幼鱼中gsdf基因,结果显示过高的gsdf表达量显著抑制性原细胞增殖,而过低的gsdf表达量甚至凋亡生殖细胞,这些结果证实gsdf的表达与牙鲆早期性原细胞增殖具有密切的关系。我们采用荧光定量分析,性分化中牙鲆四组雌雄主导群体的gsdf,amh和p450arom基因的表达。结果显示,高温增加了gsdf和amh基因的表达,并抑制了芳香化酶p450arom的表达,从而导致雄性化,而雄激素却仅增加了amh的表达,并抑制了p450arom的表达,导致雄性化。上述结果证实,牙鲆早期性原细胞增殖存在性别二态性,TGF-β信号通路(gsdf/amh/p450arom)基因的表达与性原细胞有丝分裂增殖存在密切关系,而其如何调控生殖细胞增殖还需进一步探索。本研究为丰富海水鱼类生殖细胞增殖发育积累必要资料,并为鱼类性别分化及生殖细胞的调控提供必要的理论知识。