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目的:P-6细胞结合肽(cell binding peptide P-6)是Ⅰ型胶原α1链上与骨形成作用相关的细胞结合位点的6个氨基酸序列。本研究通过观察P-6肽对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)黏附、增殖特性的影响及P-6肽复合物植入兔颅骨缺损区后的体内修复成骨特点,探讨P-6细胞结合肽的成骨作用以及作为支架材料表面修饰物用于构建仿生支架材料的可行性。材料和方法:1.体外分离培养、纯化的人骨髓MSCs以每孔5×10<’3>个细胞接种于96孔培养板中,将P-6肽以50、100、200和400ng/ml系列浓度分别加入培养板,对照组则不加P-6肽,采用MTT法测定24h、48h细胞增殖活性:将牛无机骨粒(anorganic bovine-derived bonemineral,ABM)与透明质酸水凝胶(Hy)复合成ABM水凝胶(ABM/Hy),将P-6肽以50、100、200、400ng/ml系列浓度加入ABM水凝胶,形成系列浓度的P-6/ABM水凝胶(P-6/ABM/Hy)加入96孔培养板作为实验组,每孔接种5×10<’3>个细胞。将无P-6的ABM/Hy作为对照组。培养24h、48h作黏附细胞组织学检测。2.21只新西兰大白兔随机分为3组。将P-6/ABM复合物、ABM分别植入兔顶骨骨缺损区,并设空白对照(无植入物),分别于植入后的2、4、8周进行X线、组织学、扫描电镜观察,比较p-6/ABM与ABM骨修复效果的差异。
结果:1.当P-6肽浓度低于200ng/ml时,随浓度增加,黏附作用增加;24h、48h时浓度达200ng/ml时作用最强(P<0.05)。如浓度再增加,黏附作用反而下降;24h时P-6肽浓度200ng/ml MSCs细胞增殖活性最高,48h时P-6肽浓度100ng/ml增殖活性最高。2.所有实验动物均创口一期愈合。2周时只有P-6/ABM组有新骨形成。4周、8周时新骨形成量P-6/ABM组多于ABM组,而P-6/ABM组中ABM降解速度快于后者。
结论:1.细胞黏附、增殖实验表明,P-6肽体外具有提高MSCs黏附、增殖作用。P-6肽提高细胞黏附的最适浓度为200ng/ml,P-6肽提高细胞增殖的最适浓度为100~200ng/ml。2.骨缺损修复动物实验结果表明,P-6肽/ABM复合材料生物相容性、生物降解性良好,较单纯ABM体内骨修复过程,具有缩短新骨形成时间,提高新骨形成率的特点。P-6细胞结合肽具有促进成骨作用,可作为支架材料表面修饰物用于构建仿生支架材料。