石细胞是梨果肉中特有的性状,也是影响果实食用口感和加工品质的重要因素之一。我国梨多数主栽品种由于石细胞含量较多,肉质粗糙,口感多渣,严重影响了果实的品质和经济价值。早期的研究明确了石细胞属于厚壁细胞,其次生壁中木质素的合成与积累是引起石细胞硬化的重要因素之一,而木质素的研究主要集中在模式植物中,只有少数物种中报道了果实木质素形成机制。因此,本研究在梨果实microRNA测序和全基因组MYB家族成员鉴定的研究基础上,获得了调控果实木质素生物合成的关键候选基因PbrmiR397a和PbrMYB169,并开展了基因功能和分子调控机制的分析,结果如下:1、梨果肉石细胞在盛花后（DAF）21-49天迅速形成并积累,并且石细胞中木质素一旦合成就不会被降解。通过梨果实microRNA测序和靶基因预测发现,PbrmiR397a靶向多个漆酶（LAC）基因,但两者在梨果实石细胞形成中的调控机制尚不知晓。从‘砀山酥梨’（Pyrus bretschneideri）全基因组中,共鉴定到38个LAC基因,经保守结构域及系统发育进化树分析,被分成6个进化簇。其中,有6个LAC基因在21DAF和35DAF的果肉组织中高量表达,并在达到最高值后表达量迅速下降。亚细胞定位结果显示,PbrLAC特异的分布在细胞壁中,与木质素单体生物合成的位置一致。5’-RACE和双荧光素酶试验证实,LAC基因能被PbrmiR397a剪切;并且在21-35DAF的果肉组织中,PbrmiR397a和PbrLAC的表达量存在此消彼长的关系,表明PbbrmiR397a在梨果实发育前期对PbrLAC基因的转录后调控起到了重要的作用。过量表达PbrmiR397a或者同时抑制三个PbrLAC基因,都会引起瞬时转化的梨果实木质素含量显著减少。过量表达PbrmiR397a的转基因烟草植株和野生型相比生物量之间没有显著差异,而茎杆木质素含量下降了 18-29%,但S型/G型木质素的比值没有发生改变,组织学观察发现茎杆维管束细胞数量更少、细胞壁木质素自发荧光较弱且次生细胞壁更薄。通过实时荧光定量（q-PCR）试验发现,转基因烟草中9个内源LAC基因表达量下降28-90%。2、对60份梨品种资源的重测序数据和果肉石细胞含量进行关联分析,在PbrmiR397a前体的启动子序列中发现了 6个单核苷酸多态性（SNP）,将它们与石细胞含量性状进行Fisher’s exact test分析发现,每个位点P-value都小于0.05。根据系统发育进化树分析结果,60个梨品种PbrmiR397a前体启动子序列能分成两个进化簇,各成员与果肉石细胞含量分组完全一致。基于以上结果我们开发了 SNP标记引物,用于低果肉石细胞含量品种及杂交后代的早期筛选。进一步的启动子顺式元件分析表明,6个SNP中有2个SNP会引起激素响应元件的改变。通过双荧光素酶试验证实,SNP#7改变形成的TCA-元件能够响应水杨酸信号。低果肉石细胞含量品种35DAF果肉中PbrmiR397a的表达量远远高于高果肉石细胞含量品种,而PbrLACs的表达量却与之相反。基于以上结果我们推测SNP#7的改变可能使高/低石细胞含量品种对水杨酸信号产生不同响应,导致PbrmiR397a表达量的显著差异,最终引起了果肉石细胞含量的变化。3、通过全基因组MYB基因家族成员筛选,发现与梨果实石细胞合成相关的候选基因PbrMYB169,其属于R2R3-MYB转录因子。进化树分析发现,PbrMYB169与拟南芥中促进木质素合成的AtMYB85聚为一类。亚细胞定位结果显示,PbrMYB169是一个核蛋白。结合‘砀山酥梨’果实发育过程中基因共表达网络和q-PCR分析,筛选出 4CL1、4CL2、C3H1、C3H2、CAD、CSE、CCOMT2、CCR1、CCR2、HCT2、HCT4、LAC1、LAC2、LACL15、AC18做为参与石细胞木质素合成的重要候选结构基因。双荧光素酶分析发现,PbrMYB169能够通过识别AC-元件显著激活C3H1、CCR1、CCOMT2、CAD、4CL1、4CL2、HCT2、LAC18启动子的活性,促进木质素的生物合成。过量表达PbrMYB169的转基因拟南芥中,木质素合成相关结构基因的表达量显著上升·;花序茎木质素含量增加了 20-31%;木质部细胞形态正常,但细胞壁木质素自发荧光增强且次生细胞壁增厚;而且茎尖伸长受到抑制,初生花序茎长度下降了 10-31%,植株出现矮化现象。