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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)习称老年性痴呆,是一种神经退行性疾病,多发于65岁以上的老年人。AD以老年斑、神经纤维缠结和广泛地海马神经元缺失为其主要的病理特征。现代医学将老年痴呆主要分为AD、血管性痴呆、混合性痴呆及其他痴呆。其中最常见的两种是AD和血管性痴呆。AD发病隐匿,病程长,一旦发生极难逆转。AD发病历程较为复杂,目前在医学界关于其发病和预防机制的研究正如火如荼地进行,然而关于其真正的的发病原因尚不明确,多集中在以下几种假说:Aβ的神经毒性假说、Tau蛋白过度磷酸化假说、基因突变假说、胆碱能神经元受损假说、兴奋性氨基酸毒性假说、神经细胞钙平衡失调假说和高胆固醇假说等等。以上内容也告诫我们在寻找治疗AD药物的治疗过程中,应尽量从多角度综合性分析药物对机体的作用,然后从中寻找并发现药物可能的干预途径和方式。黄连解毒汤(HLJDD)是清热解毒的代表方,主要是以黄芩、黄连、黄柏、栀子以(3:2:2:3)的比例进行配制而成。在传统中医药理论指导下,以上四味药均有苦寒之性,易伤脾胃,不易过量或者久服。在本课题组前期实验的基础之上,以HLJDD的临床折合剂量作用于Aβ25-35和鹅膏蕈氨酸联合用药诱导AD大鼠一周后,发现其生活状态明显下降(包括毛色萎黄)。因此,在此基础之上,将给药剂量降低至HLJDD对小鼠的折合剂量的1/10和1/20,探讨HLJDD在较低剂量下长期治疗对AD小鼠的作用机制。1、HLJDD改善Tg-APP/PS1小鼠转基因小鼠Morris水迷宫行为定位航行实验:在第一天的训练中,正常鼠和模型鼠逃避潜伏期已表现出显著不同(P<0.05),各给药组小鼠和模型小鼠的逃避潜伏期相似无显著性差异(P>0.05)。随着训练时间的次数增加,每组小鼠的逃避潜伏期逐渐减小,正常小鼠与模型小鼠空间记忆能力的差距越来越显著,给药组的优势也越来越明显。第三天训练结束后,模型组小鼠的潜伏期远远大于正常小鼠(P<0.001),HLJDD低剂量组(H-L组)、HLJDD高剂量组(H-H组)、小檗碱组(Ber组)和安理申组(Don组)小鼠的潜伏期均显著低于模型组小鼠(P<0.001).空间探索实验:从运动轨迹图来看,正常组与各给药组小鼠运动轨迹看似“杂乱无章”但具有目的性,而模型小鼠运动轨迹“有章可循”却无目的性。正常组与模型组相比,模型鼠在目标象限的路程百分比(P<0.05)、时间百分比(P<0.05)和穿越平台次数(P<0.05)显著降低。给药后,各给药组小鼠的路程百分比、时间百分比和穿越平台次数均发生显著性回转。不同药物对以上三个指标的回转程度均遵循以下顺序:H-L>H-H>Don>Ber。2、HLJDD改善Tg-APP/PS1小鼠中枢Ap、Tau蛋白和氧化应激状态在AD小鼠大脑的海马区和皮层区均发现了大量的Aβ堆积诱导的老年斑,HLJDD给药组海马区和皮层区的Aβ的沉积显著减少,值得注意的是H-L的作用优于H-H、Ber和Don组。与正常组比,Tg-APP/PS1小鼠中枢过氧化物歧化酶(SOD)显著下降,而谷胱甘肽过氧化物酶(GPX1)和丙二醛(MDA)变化不明显。给药四个月后,H-L和Ber能够显著升高AD小鼠脑组织中SOD的水平;H-L能够显著降低脑组织中MDA的水平;H-H和小檗碱具有升高GPX1的趋势。3、HLJDD改善Tg-APP/PS1小鼠中枢氨基酸及神经递质水平利用用超高效液相色谱-三重四极杆(UHPLC-QQQ-MS/MS)方法对AD小鼠中枢氨基酸及神经递质检测。与正常组相比,Tg-APP/PS1小鼠中枢谷氨酸,蛋氨酸和天冬酰胺水平发生显著变化。H-H和H-L能够显著升高中枢大部分的所检测的氨基酸及神经递质的水平(苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、苏氨酸和天冬酰胺),以及显著降低L-半胱氨酸。另外H-H还可以显著升高AD鼠脑组织中谷氨酸、胆碱、GABA水平,H-L显著减低脑组织中尿素的水平。小檗碱能够显著降低中枢瓜氨酸、蛋氨酸、尿素的水平。4、HLJDD改善Tg-APP/PS1小鼠中枢和外周促炎及抗炎因子水平与Con相比,在AD小鼠脑组织和外周血清系统中分别发现3个和4个差异性细胞因子。其中IFN-γ(Mod:下降,P<0.05)和IL-6(Mod:上升,P<0.05)在AD小鼠脑组织和外周血清中均发生了显著性的变化。此外,还发现AD小鼠的脑组织中IL-12p70显著性降低(P<0.01),外周血清IL-13水平显著降低(P<0.01)、MCP-1显著升高(P<0.01)。给药后,AD小鼠中枢和外周细胞因子水平均发生不同程度的变化。H-L和H-H能够回调中枢IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10 和 MIP-2 的水平,同时还能回调外周 IFN-y、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12p70、IL-13、MCP-1 和 MIP-2。5、HLJDD改善Tg-APP/PS1小鼠中枢和外周脂质代谢靶向脂质:中枢系统共发现40个病理markers(PCs=21;PEs=5;GlcCer=3;Cers=4;SM=7),外周系统共发现 13 个病理 markers(PCs=11;PEs=1;GlcCer=1;Cers=4)。与 Con 相比,17/21 PCs,5/5 PEs,3/3 GlcCers,4/4 Cers,和 5/7 SMs 在Tg-APP/PS1小鼠中枢系统中显著下降,其余的显著上升。HLJDD给药后(包含H-L 和 H-H),18/21 PCs,3/5PEs,1/3 GlcCers,3/4Cers,和 2/7 SMs 具有不同回调趋势。同时,在外周系统中,除了 PC(20:4/18:0),其他的病理markers在Mod组中均下降,H-L和H-H对外周所有病理markers具有回调作用。多元不饱和脂肪酸:与正常组相比,AD小鼠中枢多元不饱和脂肪酸(PUFAs)的水平变化不明显,而外周亚油酸(LA),花生四烯酸(AA),r-亚麻酸(GLA)和油酸(OLA)的水平显著降低。给药4个月后,H-L和H-H能够显著升高AD小鼠中枢AA、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、LA和OLA水平并显著降低GLA的含量,但对AD小鼠外周PUFAs的作用不明显。小檗碱和安理申对AD小鼠中枢和外周PUFAs的调节作用趋势与H-L和H-H相似,但小檗碱对AD小鼠中枢和外PUFAs的调节作用明显不及H-L和H-H。6、HLJDD改善Tg-APP/PS1小鼠外周血清胆汁酸代谢基于UHPLC-QQQ-MS/MS技术,对AD小鼠血清的胆汁酸进行含量测定。通过结果分析发现AD小鼠外周血清胆汁酸代谢出现异常。与正常组相比,AD小鼠血清中脱氧胆酸(DCA:P<0.001)、鼠胆酸(T-α-MCA:P<0.05)、牛磺猪去氧胆酸(THDCA:P<0.05)显著升高。在药物的干预下,AD小鼠血清中胆汁酸水平均有不同程度的回调。H-L能够显著下调AD模型鼠血清中DCA(P<0.05)、T-α-MCA(P<0.05)、THDCA(P<0.05)的水平;H-H能够显著降低血清中THDCA的水平(P<0.05);小檗碱对AD小鼠血清中毒T-α-MCA(P<0.05)和THDCA(P<0.05)具有显著下调作用;而安理申对THDCA(P<0.05)下调作用较大。7、HLJDD改善Tg-APP/PS1小鼠肠道菌群结构本章研究主要运用16 sRNA高通量测序技术研究HLJDD对Tg-APP/PS1小鼠肠道菌群的影响。根据PCA得分统计分析图,可以直观地发现所有检测的样品主要分为三大阵营,其中Con组和Mod组的样品较其他组来说虽然相互接近,但是能够明显分离,表明Tg-APP/PS1小鼠肠道微生物结构发生紊乱。而H-L、H-H和Don对Tg-APP/PS1小鼠肠道菌群的调节作用相似,而小檗碱对Tg-APP/PS1小鼠肠道菌群的调节机制有别于H-L、H-H和Don。与正常组相比:模型组拟杆菌门和放线菌门相对丰度降低,而变形菌门和厚壁菌门的相对丰度升高。给药后,与模型组相比,拟杆菌门的相对丰度在H-L组、H-H组和Don组降低,在Ber组升高;厚壁菌门相对丰度在H-H组和Ber组降低,在H-L和Don组升高;变形菌门和放线菌门的相对丰度在H-L组、H-H组、Ber组和Don组均升高。分别从科和属的水平上对样本OTU的丰度进行柱状图分析,从不同的菌在不同组间的不同颜色分布可以直观的发现规律即:H-L、H-H 和 Don 组的表达形式相似,而Ber组在科水平上的菌群的结构变化明显有别于其他组。