砷是广泛分布的无机元素，属类金属。过多摄入机体可导致急慢性砷中毒，不但能引起皮肤和多器官的损害，甚或导致肿瘤，而且对机体的免疫功能也有明显的损害。目前，对砷致病和致癌机制尚不清楚，许多研究表明，砷对组织和细胞的毒性作用是由多基因损伤和/或多基因参与多途径作用的结果。但至今尚未见从多基因关系研究肿对淋巴细胞生长影响的有关研究报道。针对这一问题，本研究设计了一种新的研究方案，即应用克隆差异表达基因的抑制性消减杂交技术，研究砷在一定浓度(T淋巴细胞生长受抑制)的条件下，诱导的差异表达基因并将其克隆后，建立三氧化二砷诱导的正向消减cDNA文库。经过测序分析并利用生物信息学技术对正向消减cDNA文库中的基因进行同源性对比，确定基因名称和功能。应用反向Northern杂交技术和普通计算机软件对克隆的差异表达基因进行表达水平检测和鉴定。应用此方案，不但在国内外砷研究领域中首次建立了T淋巴细胞的正向消减cDNA文库，而且从多基因角度初步观察到砷诱导T淋巴细胞的差异表达基因谱，并且还发现了既往在砷研究领域中从未涉及的8个基因和一个新基因(novel gene)。为今后进一步深入探讨砷中毒的分子生物学机制奠定了基础，并为砷中毒机制的研究开拓了新的实用方法。 第一部分：砷对人T淋巴细胞和Jurkat T淋巴细胞的生长抑制作用的体外实验 砷具有免疫抑制和免疫毒性作用。但对砷导致免疫抑制和免疫毒 砷诱导 T淋巴瘤细胞系（Jurka Cell line）的差异表达基因的分析研究性作用的机制不是十分清楚。为了深入了解砷对人T淋巴细胞的生长作用的影响，应用体外实验技术观察砷对人T淋巴细胞的抑制作用，并用电镜观察细胞的形态学改变。体外培养人正常T淋巴细胞和JU化印T细胞，用三氧化二砷按不同浓度（分别为opM、0．spM、lpM、ZpM、spM、lopM、sopM、IOOpM），培养2冬h后细胞计数。结果显示砷在 0．5 p M～100 p M浓度范围，对人正常 T淋巳细胞和人Jurkat T细胞的生长均有明显的抑制作用，并呈现为剂量一反应关系。三氧化二砷对人正常T淋巴细胞和Jurkat T淋巴细胞的LC50分别为 8．09和 8．9 p M。用透射电镜观察三氧化二砷（5 p M，24h）处理的Jurkat T细胞，结果显示，未用三氧化二砷处理的Jurkat T细胞超徽结构无异常改变。而砷处理的 Jurkat T细胞出现较多的凋亡细胞。主要表现为细胞体积缩小，细胞核内染色质浓集于核膜内面成团块状，或染色体断裂成碎块状，或胞核固缩边缘化等典型的凋亡细胞特征性形态改变。与未经砷处理的正常对照相比，砷处理的部分细胞功能活跃，线粒体增生，胞浆中有空泡形成，细胞膜和核膜结构完整。说明砷对细胞线粒体的影响较大，提示线粒体可能是三氧化二砷作用的主要靶细胞器。电镜观察结果提示三氧化二砷在 5 u M浓度时对 JUrkat T细胞的损伤作用与其诱导淋巴细胞凋亡有密切的关系。 羹二锚分：砷诵导的人Jurkat T淋＊细胞奎异来技吕国 的正向捎减叨 文库的拘羹 应用新近发展的差异表达基因的克隆技术，对体外培养的Jurkat T淋巴细胞用三氧化二砷（5 u M，24h）处理后，经过提取细胞 mRNA：逆转录成 ds cDNA；Rsa内切酶消化成 200叫 的片段；连接不同序列的接头；两次消减杂交和两次PCR等步骤，得到大量扩增的cDNA。然后将其连接到 pGEM－T Easy载体，转化宿主菌 JM109，在含X唱eluPTG和氨芋青霉素的选择性培养基培养，挑选出35个白色阳性克隆，经 PCR鉴定阳性克隆均含有 250叫 的基因片段。测序分析有3O个克隆中基因序列完整：另有3个克隆的基因序列中部分 2 砷诱导 T淋巴瘤细胞系（Jurkat T call）的差异表达基因的分析研究 碱基不能确定；2个克隆无测序结果，都被剔除。用生物信息学技术 将得到的30个基因序列在GenBank的核酸数据库进行同源性比较。 结果显示，3O个克隆中有24个已知基因：5个功能不详的基因；1个 无同源序列的新基因。在24个己知基因中，仅有2个基因序列相同， 为转铁蛋白基因，其它都是不同的基因。这些基因序列的同源性在 95％叶％。这些基因有氧化代谢基因（包括磷酸丙糖脱氢酶、 NADH4、焦磷酸合成酶、16s核糖体 RNA、掳琅酞 C。A合成酶、ATP 合成酶6＼转录和翻译基因（包括多聚腺昔结合蛋白、泛醒素特异性 蛋白酶14、核糖体蛋白L23、核糖体蛋白S15a、真核翻译起始因子3、 Ra bs相互作用蛋白、剪切因子、高泳动类蛋白2）：与氧化压力相关 的基因（铁蛋白）；细胞分化或凋亡相关基因（髓细胞分化初期庐答蛋 白、凋亡相关蛋白人 参与蛋白活化或信号传导的基因（酪氨酸激酶、 丝氨酸激酶、磷脂酚4磷接头蛋白上相关蛋白人5个功能不详的基因 为 KIAA0092、CGll47蛋白、GCI35、核磷酸NOpp34蛋白和骨骼肌