家蚕两种乙酰胆碱酯酶基因的互作与功能研究

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乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)是昆虫神经传导中的一种关键酶,在神经突触间通过催化神经递质乙酰胆碱来维持神经冲动的正常传递。AChE是由乙酰胆碱酯酶基因(acetylcholinesterase gene, ace)编码,鳞翅目昆虫的AChE由两种类型ace(ace1和ace2)编码。为了研究家蚕Bm-ace1和Bm-ace2两种基因的互作及功能,本文通过采用RNAi的方法,分别在细胞水平和个体水平进行研究,结果如下。在家蚕细胞系(BmN)中分别抑制ace1和ace2,运用适时荧光定量PCR检测经RNAi后ace1和ace2的转录表达水平,并测定了AChE的活性。同时,还研究了BmN在感染家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)后不同时段的ace1和ace2转录水平。结果表明,当ace1的表达被抑制到37.5%时,ace2的表达量上升为166%;当ace2的表达被抑制到33.4%时,ace1的表达量也下调,为对照的26.7%。AChE活性测定结果表明,当抑制ace1时,AChE酶活是对照的103%,当抑制ace2时,酶活降低,为对照的86.2%,AChE活性的变化趋势和基因沉默的规律一致。BmNPV感染BmN后,ace1表现逐渐上升的趋势,ace2的表达呈下调趋势。结果揭示,在BmN中,ace2担任重要的角色,可以在ace1被沉默后,通过提高ace2的转录水平维持体系AChE活性相对稳定;ace2被沉默后对ace1的转录表达也产生影响;在BmN感染BmNPV后,ace1的表达可能和细胞凋亡有关。在个体水平,研究了RNAi后家蚕脑、脂肪体、中肠和丝腺四种组织中ace1、ace2基因的互作,并测定了AChE活性和虫体对辛硫磷的抗性差异。结果表明:在脑组织中,当ace1的表达量抑制为对照的14.8%,ace2的表达量为对照的3.12倍;当ace2的表达量抑制为对照的22.1%,ace1的表达量为对照的5.8%;在中肠,丝腺和脂肪体中,当ace1被抑制后ace2也存在下调趋势。同时注射siRNA-ace1和siRNA-ace2后,ace1、ace2的表达量均下降,较单独注射时表达量变化幅度小。AChE活性测定表明,脑组织较其他组织的酶活性高,当抑制ace1时,酶活无显著变化;当抑制ace2时,活性下降,为对照的73.5%;在中肠和丝腺中,抑制ace1或抑制ace2,酶活均有显著下降;脂肪体中,酶活力表现下降但不显著。4种组织中,当ace1、ace2共同干扰后,酶的比活力均显著下降。辛硫磷抗性的结果显示:当干扰ace2和两种基因共同干扰后,虫体死亡率显著增高,分别为是对照75%和80%。本研究结果对于深入阐明昆虫两种ace基因的互作作用机制具有重要的意义。
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