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局麻药的神经毒性与体位所致产科神经并发症已引起关注,尤其是妊娠期糖尿病对局麻药神经毒性具有易感性,神经损伤发生率有增高趋势。另有研究证实,糖尿病患者接受椎管内阻滞麻醉或镇痛后,其发生神经损伤的风险可明显增加,或引发原有多发性神经病变加重。布比卡因是临床常用的局麻药之一,其所致心血管及神经毒性反应引起高度广泛关注。其机制尚不明了,尤其是神经毒性作用。研究发现,布比卡因可诱导Schwann细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)大量增多,并激活Caspase-3(细胞内与凋亡有关的蛋白酶),触发细胞凋亡。布比卡因触发ROS爆发性产生在妊娠期糖尿病及一般糖尿病患者等高糖环境下机制是否一致?目前尚不清楚。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在妊娠期糖尿病与一般糖尿病患者局麻药神经毒性易感性中起重要的病理生理作用。ERS是导致妊娠期糖尿病产妇局麻药神经毒性易感性的主要因素之一。STZ(链脲菌素)诱导的糖尿病大鼠研究证明高糖环境下神经细胞中ROS水平增高。局麻药通过干扰神经细胞内质网功能,使神经细胞原先存在的内质网应激状态更加严重,神经细胞的正常生理功能遭到破坏,氧化应激被高水平的线粒体电子传递和谷胱甘肽的消耗所恶化、加强。内质网内ROS毒性积累到一定程度,局麻药的应用触发ROS诱导ROS释放(ROS-induced ROS-release, RIRR)机制,正反馈性诱发周边正常线粒体产生、释放大量的ROS,即导致ROS爆发。内质网应激最终诱发神经细胞凋亡以及造成神经细胞的其他损伤。藉此,可推测,糖尿病或妊娠期糖尿病患者在高糖环境下与局麻药共同作用,触发ROS爆发。ERS信号转导在多个环节上与其他细胞器形成功能耦联,线粒体是ERS诱导凋亡的一重要细胞器。研究发现,神经细胞中由于内质网膜与线粒体膜接触紧密,内质网内任何微小扰动均影响到线粒体的功能发挥。在营养过剩或代谢调控信号过程出现障碍时,其负荷压力剧增,并导致内质网应激反应,可通过多种途径损伤线粒体DNA,减少线粒体数量致其功能受损,导致神经细胞凋亡。触发神经细胞凋亡可能通过多作用位点与方式实现的。课题组前期预实验发现,局麻药作用于人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤的模型中,高糖培养组局麻药导致细胞内ROS含量、细胞凋亡率显著增加。高糖环境造成神经细胞内外环境异常,影响神经细胞的代谢与机能,尤其是膜系统对其反应更为敏感,细胞膜受损后细胞代谢功能下降。高糖环境使渗透压处于非生理状态的异常,细胞膜功能及细胞器功能受损,易于受到ROS的攻击;高糖环境导致线粒体ROS生成增加,使细胞器、细胞膜、细胞核进行性损伤。葡萄糖调节蛋白(Grp)是一类存在于细胞内质网的应激蛋白,属于SHP90家族,为驻留于内质网腔的内质网标志分子伴侣,具有多种重要的生物学功能。在ERS早期,Grp78是发挥抵御机制的重要成员,增加细胞的生存力,维持内质网稳态及阻止其应激诱导的细胞凋亡。本研究对神经细胞内质网高糖环境触发ERS及神经细胞的凋亡影响,证明了内质网应激状态下出现ROS毒性积累;在局麻药作用下SH-SY5Y细胞内ROS爆发、神经细胞凋亡增多。为糖尿病与妊娠期糖尿病患者接受局麻药麻醉后神经毒性易感的分子机制提出新的理论,也为糖尿病产妇出现产科神经并发症的发病机理提供新的线索,及防治神经并发症提供新的靶点。本研究构建Grp78基因过表达慢病毒载体质粒,并构建含有目的基因的表达克隆质粒和针对靶基因不同干扰靶点的RNAi慢病毒载体质粒,共转染形成RNA干扰有效靶点的重组质粒;分别感染SH-SY5Y细胞,调节Grp78基因在SH-SY5Y细胞中的表达,研究布比卡因是否通过内质网应激由于Grp78功能减弱导致细胞内ROS爆发和细胞凋亡增加。进一步明确通过调节Grp78基因的过表达来降低内质网应激减少细胞内ROS的产生和细胞凋亡。第一章高糖培养SH-SY5Y细胞ROS增多与凋亡增加目的探讨SH-SY5Y细胞在高糖环境下细胞内ROS增多和凋亡增加情况。方法不同浓度葡萄糖培养基培养SH-SY5Y细胞,采用流式细胞仪检测细胞内ROS的产量及细胞凋亡量,MTT法检测细胞存活率,Western blotting技术检测神经细胞内GRP78相关蛋白的变化。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件分析。细胞存活率、ROS含量和细胞凋亡率采用单因素方差分析,组间比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’s T3法(方差不齐)。P<0.05为差异有统计学意义。结果各组细胞经含糖培养液培养后,细胞内ROS含量逐渐增多,具体表现为细胞内的ROS含量差异有统计学意义(P<0.01)。,组间细胞凋亡率差异有统计学意义(P<0.01)。细胞相对存活率统计学分析比较,OD差异有统计学意义(P<0.01)。组间OD差异有统计学意义(P<0.01)。细胞凋亡率统计学分析比较差异有统计学意义(P<0.01),组间细胞凋亡率差异有统计学意义(P<0.01)。免疫印迹结果显示,内质网应激时GRP78表达增强,随着应激增强,细胞凋亡增加及细胞自身修复机制的作用,GRP78表达维持在一定范围以维系细胞生存。6.1mmol/L组(0.88±0.04)、7.0mmol/L组(0.97±0.05)、7.8mmol/L组(0.83±0.04)和11.1mmol/L组(0.94±0.05)GRP78表达无统计学意义(P>0.05).随着内质网应激的进一步增强,GRP78表达降低(0.26±0.06)(P<0.05)。结论细胞ROS增多及导致细胞凋亡与高糖环境引起细胞内质网应激有关。第二章布比卡因致高糖培养SH-SY5Y细胞ROS增多与凋亡增加目的探讨布比卡因作用于高糖培养的SH-SY5Y细胞内ROS增多和凋亡增加情况。方法不同浓度葡萄糖培养基培养SHSY-5Y细胞,经1mmol/L布比卡因作用6h。采用流式细胞仪检测细胞内ROS的产量及细胞凋亡状况、MTT法检测细胞存活率、Western blotting技术检测神经细胞内GRP78相关蛋白的变化。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件分析。细胞存活率、ROS含量、细胞凋亡率和GRP78相关蛋白的变化采用单因素方差分析,组间比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’s T3法(方差不齐)。P<0.05为差异有统计学意义。结果各组含不同浓度糖培养基的细胞经布比卡因作用6h检测细胞内ROS含量。在葡萄糖浓度为5.56mmol/L、6.1mmol/L、7mmol/L组间ROS含量差异无统计学意义(P>0.05)。葡萄糖浓度为7.8mmol/L、11.lmmol/L和13.3mmol/L时,各组细胞内ROS含量差异有统计学意义(P<0.01)。经布比卡因作用6h后,各组细胞相对存活率差异具有统计学意义(P<0.01)。组间差异均具统计学意义(P<0.05)。经布比卡因作用6h后各组细胞凋亡率差异具有统计学意义(P<0.01)。组间细胞凋亡率差异均具有统计学意义(P<0.01)。Western blot检测结果,单独效应分析发现在布比卡因处理6h后,5.56mmol/L组和6. lmmol/L组分别为1.02±0.12和0.97±0.06,均高于7.0mmol/L组(0.39±0.04),差异有统计学意义(P<0.01)。7.8mmol/L组(0.98±0.06)高于7.0mmol/L组(0.39±0.04),差异有统计学意义(P<0.01)。5.56mmol/L组、6.1mmol/L组和7.8mmol/L组相比,差异没有统计学意义(P>0.05)。11.1mmol/L组与其他各组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论细胞ROS增多及导致细胞凋亡增加与布比卡因进一步加强细胞内质网应激有关,引起细胞内ROS爆发,从而导致细胞损伤和凋亡。Grp78功能减弱导致细胞内质网应激进一步加强。第三章布比卡因增强高糖培养SH-SY5Y细胞的毒性目的探讨布比卡因对高糖环境下的SH-SY5Y细胞毒性作用。方法不同浓度葡萄糖培养基培养SH-SY5Y细胞及经1mmol/L布比卡因作用6小时,采用流式细胞仪检测各组细胞内ROS的产量及细胞凋亡状况、MTT法检测细胞存活率、Western blotting技术检测神经细胞内GRP78相关蛋白的变化。计量资料以均数±标准差(X±S)表示,采用SPSS13.0统计软件分析。细胞存活率、ROS含量和细胞凋亡率采用两因素析因设计资料方差分析,组间比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’s T3法(方差不齐)。P<0.05为差异有统计学意义。结果除糖浓度6.1mmol/L和7mmol/L组外,布比卡因作用高糖环境下的SH-SY5Y细胞前后细胞内ROS检测,差异具统计学意义(P<0.01)。布比卡因作用高糖环境下的SH-SY5Y细胞前后细胞存活率检测,差异具统计学意义(P<0.01)。Western Blot检测布比卡因作用高糖环境下的SH-SY5Y细胞前后各组细胞GRP78蛋白表达水平,差异具统计学意义(P<0.01)。结论高糖环境引起细胞内质网应激,细胞ROS增多及细胞凋亡增加。布比卡因的应用进一步加强细胞内质网应激,引起细胞内ROS爆发,导致细胞损伤和凋亡。第四章Grp78基因过表达慢病毒载体构建和包装及鉴定目的探讨Grp78基因过表达慢病毒载体构建和包装及鉴定。方法运用慢病毒载体GV261,采用基因工程技术,获取目的基因片段,构建重组质粒,制备感受态细胞,转化,对阳性克隆进行测序。最后对慢病毒包装和滴度检测。结果阳性克隆测序比对结果说明测通。熔解曲线没有出现杂峰,也未出现主峰的异常增宽。表明实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增。Grp78基因过表达慢病毒载体构建和包装成功。结论内质网应激与Grp78功能减弱关系密切,Grp78基因过表达慢病毒载体构建和包装成功为研究内质网应激中Grp78的功能获取良好的研究工具,可进一步论证Grp78对内质网应激的作用。第五章RNAi慢病毒外源筛靶与内源验证目的制备含目的基因(Grp78基因)过表达敲减的RNAi慢病毒载体重组质粒。方法通过RNAi慢病毒载体制备和目的基因过表达载体构建、过表达质粒表达检测,最后行Western blot外源筛选有效RNAi载体。通过上述实验流程得到含目的基因表达敲减的RNAi慢病毒载体重组质粒,RNAi慢病毒大量包装,通过Real time PCR验证内源性目的基因表达敲减。结果HSPA5-RNAi(8747-2)靶点对目的基因的表达有敲减作用,因而是有效靶点。通过基因工程成功制备含目的基因(Grp78基因)过表达敲减的RNAi慢病毒载体重组质粒。结论内质网应激与Grp78功能减弱关系密切,Grp78基因过表达敲减的RNAi慢病毒载体重组质粒构建和包装成功为研究内质网应激中Grp78的功能获取良好的研究工具,可进一步论证Grp78对内质网应激的作用。第六章布比卡因对高糖培养Grp78基因过表达/干扰SH-SY5Y细胞毒性的作用目的探讨Grp78在内质网应激中的作用。方法不同浓度葡萄糖培养基培养Grp78基因过表达和干扰的SH-SY5Y细胞及经1mmol/L布比卡因作用6h,采用流式细胞仪检测各组细胞内ROS的产量及细胞凋亡情况。计量资料以均数±标准差(X±S)表示,采用SPSS13.0统计软件分析。细胞内ROS含量和细胞凋亡率采用多因素析因设计资料方差分析,组间比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’s T3法(方差不齐)。P<0.05为差异有统计学意义。结果细胞内ROS检测及细胞凋亡情况,Grp78基因过表达SH-SY5Y细胞较Grp78基因正常表达SH-SY5Y细胞少,差异有统计学意义(P<0.01)。而Grp78基因干扰的SH-SY5Y细胞较Grp78基因正常表达SH-SY5Y细胞明显增高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论Grp78基因过表达对SH-SY5Y细胞内质网应激有较好的防护作用。而Grp78基因干扰对SH-SY5Y细胞内质网应激缺乏防护作用。全文结论一、通过不同浓度糖培养SH-SY5Y细胞,检测细胞内ROS表达水平及细胞凋亡量,证实细胞ROS增多及导致细胞凋亡增加与高糖环境引起细胞内质网应激有关。Grp78功能减弱可导致细胞内质网应激加强。二、通过布比卡因作用不同浓度糖培养SH-SY5Y细胞,检测细胞内ROS表达水平和细胞凋亡量,证实细胞ROS增多及导致细胞凋亡增多与布比卡因进一步加强细胞内质网应激有关,引起细胞内ROS爆发,从而导致细胞损伤和凋亡。Grp78功能减弱导致细胞内质网应激进一步加强。三、内质网应激与Grp78功能减弱关系密切,增强Grp78功能细胞可有效适应内质网应激而逃避应激引起的凋亡。因而,防治高糖环境与局麻药致神经毒性损伤,Grp78可作为靶向治疗的分子靶标。本研究采取Grp78基因过表达和Grp78基因干扰方法进一步论证Grp78对内质网应激的作用。构建、包装、鉴定Grp78基因过表达慢病毒载体,重组质粒感染正常SH-SY5Y细胞株,得到实验所需Grp78基因过表达SH-SY5Y细胞。通过对RNAi慢病毒载体外源筛选和内源鉴定,重组质粒感染正常SH-SY5Y细胞,得到实验所需Grp78基因干扰(敲减)SH-SY5Y细胞。四、通过不同浓度糖分别培养Grp78基因过表达和Grp78基因干扰SH-SY5Y细胞,检测细胞ROS表达水平及细胞凋亡量;经布比卡因作用不同浓度糖培养的SH-SY5Y细胞,检测细胞ROS表达水平和细胞凋亡量。Grp78基因过表达SH-SY5Y细胞内ROS和细胞凋亡在不同浓度糖培养和布比卡因作用下,细胞ROS增多和细胞凋亡不明显;Grp78基因干扰SH-SY5Y细胞内ROS和细胞凋亡在不同浓度糖培养和布比卡因作用下,细胞ROS增多和细胞凋亡显著。Grp78基因过表达SH-SY5Y细胞内ROS和细胞凋亡较正常SH-SY5Y细胞均明显降低。相比之下,Grp78基因干扰SH-SY5Y细胞内ROS和细胞凋亡较正常SH-SY5Y细胞均增加显著。结果提示,Grp78功能减弱,细胞内质网应激明显,细胞内ROS增多,布比卡因诱导内质网应激进一步加重,ROS诱导ROS释放,ROS爆发,从而导致细胞损伤和凋亡。增强Grp78功能,减少细胞内质网应激引起的ROS积累可有效降低布比卡因导致的ROS诱导ROS释放,从而避免ROS爆发,减轻细胞损伤和凋亡。