近些年来,我国载人航天事业飞速发展,随之而来的失重性骨流失问题已不容忽视。航天飞行中机体会出现骨钙流失,骨密度减小,骨骼机械强度下降等现象,在返回地面后短时间内仍无法完全恢复;这不仅会危及航天员的生命健康,而且可能会影响到航天任务的执行与开展情况。本研究首次以黑木耳蛋白为载体,深入研究其水解肽与钙离子形成的金属离子螯合物对模拟微重力诱导骨流失的防护作用。该肽钙螯合物既可以通过机体对肽的特殊吸收机制加速其在微重力环境下中对钙离子的吸收和利用,提高其生物学效价;同时也为黑木耳蛋白等天然产物提取物的应用提供了一个新的思路和方向。本课题主要研究内容如下:黑木耳蛋白提取条件的优化:首次研究压力对黑木耳蛋白提取效果的影响,通过比较高压、减压与常压条件下黑木耳蛋白得率的高低,确定高压均质法为黑木耳蛋白的最优提取方法,最佳提取条件为料液比1:104g/mL,均质压力25 MPa,均质时间25 min,蛋白得率可达5.35%。蛋白水解方法及条件的筛选:对所得黑木耳蛋白分别进行不同时间的酶解和碱解,通过研究不同水解肽及其肽钙螯合物对体外成骨细胞(OB)促增殖活性作用的差异筛选出最优肽段,并确定胰蛋白酶酶解为水解方法,酶解条件为pH 8.0,37℃条件下酶解30 min;该条件下所得肽钙螯合物促OB增殖率可高达90%。黑木耳多肽的纯化:采用半制备型高效液相设备对最优肽段的功能组分进行分离纯化,通过比较不同出峰时间所得组分及对应的肽钙螯合物促OB增殖活性的差异确定主要功能组分为AP-2。并对AP-2的蛋白分子量及其氨基酸组成进行分析与测定。研究结果表明主要功能组分AP-2为分子量为10573 Da多肽,该多肽含所有人体必需氨基酸,富含缬氨酸和蛋氨酸,是一类优质的植物蛋白资源。肽钙螯合条件的优化:分别以肽钙螯合比,螯合pH,螯合时间和螯合温度为单因素,以促OB增殖率作为响应值,通过响应面优化法确定功能组分AP-2与钙离子螯合物的最佳工艺条件为肽钙比2.4:1,pH 9.0,螯合时间63 min及螯合温度68℃,该条件下促OB增殖率可达98.2%。模拟微重力诱导骨流失体外防护作用研究:采用二维双相多样本回转器(2D-RWVS)系统建立骨流失模型,研究结果表明功能组分AP-2与钙离子所形成的螯合物可有效增加模拟微重力下OB中钙含量,并能够提高其碱性磷酸酶(ALP)活力,对模拟微重力诱发的骨流失具有一定程度的防护作用。模拟微重力诱导骨流失体内防护作用研究:以昆明小鼠为试验对象,采用尾吊法建立空间微重力模型。动物实验结果表明黑木耳肽钙螯合物不仅可以有效恢复模拟微重力引起的免疫脏器损伤,并能够减少小鼠负重骨中骨密度的下降,增加骨中无机矿物盐含量;而且能够显著抑制血清中抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)活力,提高ALP活力,对模拟微重力诱导的骨流失具有一定程度的防护作用。本课题为开展空间微重力诱导骨流失防护途径的研究提供了理论基础,并对进一步开发新型骨流失防护剂提供了一定的价值;同时,对地面骨质疏松的研究具有一定的参考意义。