研究背景： 镍及其化合物是人类在职业和环境中广泛接触的一类金属化学物，具有多系统、多器官、多细胞毒性。在多种生产过程中，如镍采矿、精炼、电镀、镍—镉电池制造、不锈钢的制造以及含镍固体废物的焚烧等都可在周围环境中产生大量含镍烟雾，人们可以因职业暴露和非职业暴露接触。镍化合物可经过多种途径进入机体，其中吸入接触是人类暴露于镍的主要方式。人群职业流行病学调查和动物实验均己证实镍的暴露可以引起肿瘤，主要为呼吸道肿瘤。国际癌症研究中心已于1990年将镍及其化合物列为第一类致癌物。镍致癌的机制极其复杂，目前的研究发现镍可以损伤基因组DNA、诱导基因组的表观遗传变异、产生ROS、活化肿瘤相关的信号传导通路、以及影响与肿瘤发生密切相关的转录因子的活性，但其确切的致癌机制仍未完全明了。由于镍化合物的低诱变性及强致癌性，提示表观遗传学改变可能在镍致癌过程中起作重要作用，故目前研究热点主要集中于其表观遗传致癌机制。 表观遗传学(epigenetics)是与遗传学(genetics)相对应的概念。在生物体内，遗传学信息提供了生命所必需的蛋白质的模板；而表观遗传学的信息提供了何时、何处和何种方式应用这些遗传学信息的指令，在时空顺序上控制基因的表达，它不涉及DNA序列改变但又可以通过细胞分裂遗传给子代细胞。表观遗传学机制主要涉及DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰、染色质重塑以及MicroRNA、SiRNA等。目前，表观遗传学研究已成为后基因组时代的生命科学研究的核心和热点之一。表观遗传学异常常导致人类多种疾病，特别在肿瘤的发生发展过程中，表观遗传学改变起重要作用。 为了探讨这些问题，本课题将利用该转化模型，检测细胞恶性转化过程中基因组总体DNA甲基化水平，筛选表观遗传学失活的相关DNA修复基因，分析其表观遗传调控机制，以期揭示镍致癌过程中表观遗传作用，寻找镍致癌早期可能的表观遗传生物标记物，为其应用于镍作业人群的研究提供理论依据。 方法： 1.细胞染毒：分别以0.25μg/cm2，0.5μg/cm2，1.0μg/cm2，2.0μg/cm2结晶型NiS处理人支气管上皮细胞系(16HBE)24 h，隔天再次进行相同处理，分别处理1、2、3次。 3.应用定量聚合酶链式反应(Q-PCR)及Western Blot方法检测结晶型NiS处理细胞和转化细胞中相关DNA修复基因(MGMT、hMLH1、hMSH6、BRCA1)的变化； 4.建立甲基化荧光PCR(MethyLight)技术，并应用该技术和亚硫酸氢盐测序技术定量分析结晶型NiS处理细胞和转化细胞中MGM7基因启动子CpG岛DNA甲基化改变；同时分析DAC对MGMT基因CpG岛启动子DNA甲基化的影响； 5.应用Q-PCR及Western Blot方法检测结晶型NiS处理细胞和转化细胞中DNA甲基化酶(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)和DNA甲基化结合蛋白(MeCP2、MBD2)的变化； 6.应用RNAi技术建立DNMT1缺陷的转化细胞株(NSTC2shDNMT1)，并应用亚硫酸氢盐测序技术分析NSTC2shDNMT1细胞中MGM7基因CpG岛启动子DNA甲基化的水平； 7.建立定量染色质免疫沉淀(Q-ChIP)技术，并检测结晶型NiS处理细胞和转化细胞中MGMT基因启动子区组蛋白修饰的改变；同时分析DAC和TSA对MGMT基因启动子区组蛋白修饰的影响； 8.应用Q-ChIP技术检测结晶型NiS处理细胞和转化细胞中MGMT基因启动子区DNMT1和DNA甲基化结合蛋白的结合力水平；同时分析DAC和shDNMT1对MGMT基因启动子区DNMT1和DNA甲基化结合蛋白的结合力的影响。 结果： 1.5-mC甲基化免疫荧光试验结果显示，结晶型NiS处理细胞DNA甲基化免疫荧光的强度均有不同程度降低，转化细胞DNA甲基化免疫荧光的强度明显降；Sss1甲基转移酶法定量分析结果显示，与阴性对照组细胞相比，0.25μg/cm2、0.5μg/cm2、1.0μg/cm2、2.0μg/cm2的结晶型NiS处理3次的细胞基因组总体甲基化程度分别降低了4.9％、8.1％、19.6％、17.7％，转化细胞(NSTC1、NSTC2)基因组总体甲基化程度降低更为显著，分别降低了43.6％和46.8％。结果表明结晶型NiS诱发细胞恶性转化过程中，整体基因组DNA甲基化水平降低。 2.Q-PCR和Western Blot结果显示，与阴性对照组细胞相比，结晶型NiS处理细和转化细胞中hMLH1、hMSH6、BRCA1基因表达无明显改变，而MGMT基因表达下调，并在NiS处理细胞中存在剂量依赖关系，在NiS转化细胞中已表达缺失；Q-PCR、Western Blot及免疫荧光分析证实DNA甲基化转移酶抑制剂DAC和组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可分别回复转化细胞中MGMT基因的表达，结果提示在NiS诱发的细胞转化过程中MGMT基因表达的下调及失活是受表观遗传调控。 3.成功建立了甲基化荧光PCR(MethyLight)技术，并应用该技术定量分析结晶型NiS处理细胞和转化细胞中MGMT基因启动子CpG岛(甲基化热点区域2)DNA甲基化模式，结果发现不同剂量的NiS处理细胞中MGMT基因CpG岛启动子DNA甲基化水平有一定升高，甲基化参照百分比(PMR)分别为2.4％、4.5％、4.8％和6.8％；转化细胞MGMl瑾因CpG岛启动子DNA甲基化水平显著升高，甲基化参照百分比(PMR)分别为74.6％和53.8％，DAC和TSA分别处理转化细胞后，DNA甲基化水平显著降低。亚硫酸氢盐测序技术进一步分析NiS处理细胞和转化细胞中MGMT基因CpG岛启动子(甲基化热点区域1)DNA甲基化水平，结果显示，NiS处理细胞(NiS2)和转化细胞(NSTC2)MGMT基因甲基化水平分别为25.6％和68.9％，而阴性对照组细胞仅为7.5％；DAC处理转化细胞后，DNA甲基化水平下降了77.4％。结果表明，在NiS诱发的细胞转化过程中，MGMT基因启动子CpG岛DNA高甲基化是其表达下调或失活的重要原因。 4.Q-PCR和Western Blot方法检测DNA甲基化酶(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)和DNA甲基化结合蛋白(MeCP2、MBD2)的表达，结果发现，与阴性对照组细胞相比，NiS处理细胞和转化细胞中DNMT3a、DNMT3b、MeCP2、MBD2表达无明显改变，而DNMT1表达上调，在NiS处理细胞中升高了1.6～2.0倍，而在转化细胞中升高了2.6～3.4倍，提示在NiS处理细胞和转化细胞中DNMT1可能是引起DNA高甲基化的重要调控因子。为此，应用RNAi技术成功建立DNMT1缺陷的转化细胞株(NSTC2shDNMT1)，并应用亚硫酸氢盐测序技术分析NSTC2shDNMT1细胞中MGMT基因启动子CpG岛DNA甲基化的水平，结果发现MGMT基因甲基化水平降低了70.4％，提示DNMT1在维持MGM7基因启动子CpG岛DNA高甲基化过程中起重要作用。 5.成功建立了定量染色质免疫沉淀(Q-ChIP)技术，并应用该技术定量分析组蛋白修饰，结果发现，与阴性对照组细胞相比，NiS处理细胞和转化细胞中组蛋白H4，组蛋白H3K9乙酰化水平降低，组蛋白H3K9双甲基化水平升高；DAC和TSA均可逆转NiS处理细胞和转化细胞中组蛋白修饰的改变。结果表明，在NiS诱发的细胞转化过程中，MGMT瑾因启动子区高组蛋白H3K9双甲基化、低组蛋白H4和组蛋白H3K9乙酰化是其表达抑制的重要表观遗传学特征。 6.Q-CHIP技术检测结晶型NiS处理细胞和转化细胞中MGMT基因启动子区DNMT1和DNA甲基化结合蛋白的结合力水平，发现DNMT1、甲基化CpG结合蛋白2(MeCP2)和甲基化DNA结合域蛋白2(MBD2)在MGMT基因启动子区结合水平升高，而甲基化DNA结合域蛋白1(MBD1)的结合水平与阴性对照组细胞中水平相似，均表现为结合力低下。结果表明，DNMT1、MeCP2和MBD2被共同募集至MGMT基因CpG岛启动子区，负责维持MGMT基因启动子CpG岛DNA高甲基化，参与MGMT基因表达抑制的调控。ChIP-MSP技术进一步证实了DNMT1、MeCP2与MGMT基因启动子CpG岛高甲基化高度相关。 结论： 1.结晶型NiS诱发细胞恶性转化过程中，整体基因组DNA甲基化水平降低和MGMT基因的表观遗传失活，使得基因组的不稳定性增强，这是引发多种遗传学和表观遗传学改变的积累，最终导致细胞恶变的早期驱动力。 2.在结晶型NiS诱发细胞恶性转化过程中，DNMT1表达上调、MGMT基因启动子CpG岛高甲基化、组蛋白修饰及MBDs的结合，这些分子事件交互调节(Crosstalk)，协同调控MGMT基因表达的抑制。