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第一章DNA疫苗pSVK-CAVA高稳定性宿主菌的筛选与鉴定 目的:从多种不同基因型的大肠杆菌中筛选出适合本研究大分子质粒DNA疫苗的宿主菌，并建立三级种子库。 方法:将质粒pSVK-CAVA(14.7kb)转化4种大肠杆菌化学感受态细胞并提取质粒，通过琼脂糖凝胶电泳实验检测质粒的形态结构。对基因工程菌进行生化检测，并通过连续传代法和酶切鉴定进行稳定性检测，同时将质粒DNA瞬时转染至293T细胞中检测质粒表达能力。选取质粒含量最高和稳定性最好的工程菌作为原始种子分装冻存，将原始种子库扩大培养，逐级建立好主种子库和工作种子库，即三级种子库。 结果:确定了XL10-Gold作为质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的宿主菌，基因工程菌传代稳定性和结构稳定性良好，工程菌生化特性未发生改变，质粒能在293T细胞中体外表达，成功建立了达到中试要求的三级种子库。 结论:大肠杆菌XL10-Gold适合作为质粒DNA疫苗的宿主菌，解决了大质粒在常用宿主菌中不稳定的难题。 第二章响应面法优化质粒DNA疫苗工程菌发酵培养基 目的:筛选出基础培养基，并利用统计学方法对肿瘤疫苗工程菌发酵培养基进行优化，提高质粒DNA产量，降低成本。 方法:通过摇瓶试验，利用单因素法对几种备选基础培养基进行筛选，之后应用Plackett-Burman试验设计方法和响应面法，对初始培养基7种组分配比进行优化;利用Minitab软件对实验数据进行多元回归分析，并建立3种主要因素与质粒DNA产量之间的函数关系。将最终优化的配方进行3次重复验证实验。 结果:筛选出TB培养基为基础培养基，质粒容积产量达到9.9mg/L，比LB培养基提高了接近1倍。培养基3种主要因素的最佳浓度为:酵母提取物16.61g/L，甘油3.05ml/L，硫酸镁0.185g/L，质粒DNA产量能达到12.38mg/L。3次验证实验所测得的质粒DNA产量平均能达到12.28mg/L，与预测结果基本一致。 结论:利用响应面法对肿瘤疫苗工程菌发酵培养基优化可以显著提高疫苗质粒DNA产量。