目的:建立裸鼠胃癌原位移植模型,为下一步miRNA表观遗传调控研究的进行提供稳定可靠的实验载体。方法:第一节:采用SGC-7901细胞株形成的瘤组织块原位种植到裸鼠的胃浆膜层下,不同时期分批处死裸鼠,观察肿瘤的生长和转移情况。第二节:采用SGC-7901、BGC-823两个胃癌细胞株形成的皮下瘤块,用改良的医用胶粘贴法将瘤组织块移植到裸鼠胃浆膜层下,建立胃癌原位模型,并比较两组模型间的不同生物学特性。结果:第一节:2-4周,原位肿瘤体积变化不明显;6周时,肿瘤体积稍增大,胃壁增厚,胃腔有缩小,淋巴结和肝脏有转移瘤灶;8-12周,肿瘤体积逐渐明显增大,压迫毗邻脏器,胃腔明显缩小或消失,淋巴结(58%)、肝(78%)、肾(39%)、腹膜或膈膜(81%)均有转移发生。免疫组织化学显示原位肿瘤、转移瘤中CK-20、EMA表达呈阳性。第二节:两组模型的原位肿瘤均呈现巨大瘤块,压迫并侵犯周围组织脏器,胃腔缩小或完全消失,贲门、幽门不同程度梗阻。SGC-7901组与BGC-823组肿瘤平均体积分别为9.66±4.80cm~3和1.40±0.91cm~3(p<0.05)。与SGC-7901组模型鼠相比,BGC-823组自然生存期较短(p<0.05; 23d vs 84d);BGC-823组淋巴结、肝、肾、脾、睾丸、腹膜或膈膜的肿瘤转移率明显高于前者(除肝、肺、腹膜或膈膜外均有显著性差异,p<0.05或p<0.01)。病理组织学上,两组模型鼠各自的原位肿瘤与转移瘤均性质相同,肿瘤异型性明显,可见粘液分泌。与SGC-7901组相比,BGC-823组肿瘤细胞分化更低,体积较小,未见到明确的腺样分化,毛细血管分布更丰富;免疫组织化学染色显示SGC-7901肿瘤中CK-20、EMA表达呈阳性,BGC-823模型的CK-20、EMA表达呈阴性。结论:第一节:该模型模拟了临床胃癌发展的过程,可为治疗胃癌的前期试验提供实验载体,并寻找实施治疗的合适靶点。第二节:SGC-7901、BGC-823原位移植模型表现出不同的生物学特性,后者的恶性程度更高,两者均可用于胃癌发生机制及其治疗探索的研究。第二部分miRNA在胃癌中的表达及与临床病理因素的相关性分析目的:以下调的miRNA为研究对象,在胃癌组织和细胞中验证并筛选miRNA表达谱,为下一步miRNA表观调控研究的进行提供目标基因。并探讨miRNA的表达与临床病理因素之间的关系。方法:采用荧光定量PCR (RTQ-PCR)的方法检测30例胃癌组织和正常胃粘膜组织、2个胃癌细胞株和1个正常胃粘膜上皮细胞株中、去甲基化药物5-aza-2’-dc处理胃癌细胞株前后miR-9, miR-433,miR-19b, miR-370的表达。结果:按一定参数在表达下调的miRNAs基因上游5000bp范围内进行CpG岛查找,最后确定符合研究条件的目标基因为miR-9, miR-433, miR-19b, miR-370。RTQ-PCR结果显示,与正常胃粘膜组织相比,癌组织中miR-9, miR-433, miR-19b, miR-370表达均下调,除miR-19b外均有统计学显著性差异(p<0.05);与GES相比,在胃癌细胞株中miR-9, miR-433, miR-19b, miR-370表达均下调,但仅miR-9表达有统计学显著性差异(p<0.05)。PCR结果显示,与正常胃粘膜组织相比,miR-9、miR-433、miR-19b、miR-370表达下调;与正常胃粘膜上皮细胞相比,除miR-9外其余miRNAs表达无明显差异。RTQ-PCR结果显示,5-aza-2’-dc去甲基化处理后,胃癌细胞株SGC-7901中miR-9、miR-433、miR-19b、miR-370表达均上调,miR-9、miR-19b的三个处理浓度均有显著差异(p<0.01),其中5μM浓度的去甲基化作用最显著;miR-370仅10μM组有显著差异(p<0.05);胃癌细胞株BGC-823中miR-9、miR-433、miR-19b、miR-370表达均上调,miR-9、miR-19b、miR-370的三个处理浓度均有显著差异(p<0.01),其中5μM浓度的去甲基化作用最显著;miR-433仅10μM组有显著差异(p<0.01)。另研究发现, miRNAs表达与各种临床病理因素有一定相关性。miR-9表达下调与胃癌癌灶大小、淋巴结转移相关(p<0.05), miR-433表达下调与性别、癌灶部位、病理分级、淋巴结转移相关(p<0.05或p<0.01), miR-19b表达下调与性别、癌灶部位、病理分级相关(p<0.01), miR-370表达下调与癌灶部位、病理分级、淋巴结转移相关(p<0.01)。结论:胃癌组织及胃癌细胞株中miR-9, miR-433, miR-19b, miR-370的表达下调,与临床病理因素存在一定的相关性,可作为评价胃癌预后的生物学指标。第三部分miRNA在胃癌中的表观遗传调控机制的研究目的:探讨表达下调的miRNA中是否存在表观遗传调控的机制,并在体内外实验中进行验证。方法:第一节:采用重亚硫酸盐测序法(BSP)、甲基化特异性PCR(MSP)法检测30例胃癌组织和正常胃粘膜组织、2个胃癌细胞株和1个正常胃粘膜上皮细胞株中miR-9启动子区的甲基化状态。第二节:采用两种不同的去甲基化方法(5-aza-2’-dc、siRNA-DNMT1质粒转染)处理胃癌细胞株SGC-7901和原位胃癌动物模型,进行体外、体内实验的干预处理,检测处理后miR-9的甲基化变化(BSP法检测)、miR-9表达的变化(RTQ-PCR法检测)、以及胃癌细胞的增殖活性变化(MTT、Transwell小室浸润实验)和胃癌模型的生物学改变。结果:第一节:在生物学网站搜索miR-9, 433, 19b, 370启动子是否位于CpG岛内,结果显示只有miR-9符合条件,检测其上游500bp-上游1500bp启动区CpG岛的甲基化程度,分两段扩增(miR9-1、miR9-2)。BSP结果显示,与正常胃粘膜组织相比,胃癌组织中miR-9-1启动子区的CpG岛甲基化程度较高(p<0.05);与GES相比,胃癌细胞株SGC-7901、BGC-823中miR-9-1启动子区的CpG岛甲基化程度明显增高,具有显著差异(p<0.01;p<0.005)。在胃癌组织和细胞株中,miR-9-2启动子区的CpG岛甲基化程度均明显增高,具有显著性差异(p<0.005)。MSP结果显示,胃癌组织中MiR-9启动子区的CpG岛存在高甲基化。第二节:BSP结果显示,胃癌细胞株SGC-7901中,5-aza-2’-dc处理后miR-9-1启动子区的CpG岛甲基化程度降低(p<0.05),miR-9-2启动子区的CpG岛甲基化程度明显降低(p<0.005)。siRNA-DNMT1质粒转染后,miR-9-1启动子区的CpG岛甲基化程度降低(p<0.05),miR-9-2启动子区的CpG岛甲基化程度明显降低(p<0.01)。原位胃癌模型中,5-aza-2’-dc处理后胃肿瘤中miR-9-1启动子区的CpG岛甲基化程度有降低,但无统计学差异(p>0.05),miR-9-2启动子区的CpG岛甲基化程度明显降低(p<0.005)。siRNA-DNMT1质粒转染后,胃肿瘤中miR-9-1启动子区的CpG岛甲基化程度明显降低(p<0.01),miR-9-2启动子区的CpG岛甲基化程度有降低(p<0.05)。RTQ-PCR结果显示,在SGC-7901胃癌细胞中,5-aza-2’-dc (5μM)处理后miR-9表达明显上调(p<0.01) ;siRNA-DNMT1质粒转染后miR-9表达明显上调(p<0.05)。在原位胃癌模型中,5-aza-2’-dc处理后模型胃肿瘤中miR-9表达上调,但无统计学显著差异(p>0.05) ;siRNA-DNMT1质粒转染后胃肿瘤中miR-9表达明显上调(p<0.01)。MTT结果显示,不同浓度5-aza-2’-dc处理后,SGC-7901胃癌细胞的增殖活性均降低,与处理前相比三个浓度均有显著差异(p<0.05),同时发现5μM、10μM组增殖活性降低较明显(p<0.01),两者作用效果相当,无统计学差异。Transwell结果显示,5-aza-2’-dc处理后SGC-7901胃癌细胞的侵袭能力减弱,穿过小室膜的细胞个数明显少于未处理组(10.75±5.37 vs. 30.00±10.62; p<0.05)。研究发现,用5-aza-2’-dc处理原位模型后、siRNA-DNMT1质粒转染后建立原位模型,4周时处死裸鼠,发现处理后模型鼠的原位肿瘤体积小于处理前,但两种方法处理前后无明显统计学差异。结论: miR-9存在启动子区相关的CpG岛高甲基化调控,导致其表达下调。体内、外去甲基化干预实验也验证了miRNA甲基化相关的致癌机制。