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鸡坏死性肠炎是由A型和部分C型产气荚膜梭菌引起的重要禽类肠道疾病，对全球家禽生产造成重大的经济影响。该病主要通过在饲料或饮水中添加抗菌药物控制，自欧盟立法禁止在饲料中添加抗菌促生长剂后此病频频发生，疫苗免疫作为替代抗菌药物的新途径被广泛研究。本试验对已初步鉴定的免疫原性蛋白延伸因子Tu（EF-Tu）和丙酮酸铁氧化还原酶（PFO）进行克隆和原核表达，并利用pcDNA3.1（+）载体构建真核表达质粒，评价其对鸡坏死性肠炎的免疫保护作用。本试验根据已发表的产气荚膜梭菌ATCC13124株EF-Tu和PFO基因序列设计引物，成功克隆了EF-Tu和PFO基因的全长序列，大小分别为1194bp和3516bp，同时构建EF-Tu和PFO的原核表达质粒pGEX-EF和pGEX-PFO，表达蛋白大小分别为69kDa和154kDa。蛋白纯化后免疫新西兰大白兔，制备兔抗EF-Tu和PFO多克隆抗体，抗体效价分别达到218和221。Western blot和间接免疫荧光试验证明制备的多克隆抗体能分别与pGEX-EF和pGEX-PFO重组蛋白、ATCC13124株细菌培养物和菌体裂解液及ATCC13124株感染的小鼠肠组织中菌体发生特异性结合，有良好的反应性。本试验将EF-Tu和PFO基因亚克隆至pcDNA3.1（+）真核表达载体中，构建了重组真核表达质粒pcDNA-EF和pcDNA-PFO。通过脂质体转染法将pcDNA-EF和pcDNA-PFO体外瞬时转染BHK21细胞，抗EF-Tu和PFO多克隆抗体能够检测到目的蛋白在细胞中的表达。免疫保护试验动物分为4组，分别为pcDNA-EF真核表达质粒免疫组（EF）、pcDNA-PFO真核表达质粒免疫组（PFO）、pcDNA3.1（+）空载体质粒组（pcDNA）和不免疫不攻菌组（正常组），进行免疫攻菌实验。分两次免疫，间隔10天。最后一次免疫后7天，以产气荚膜梭菌ATCC13124菌株（108cfu）连续攻菌5天。通过攻菌前后体重变化、血清抗体变化、小肠内细菌定植及肠道病变指数与免疫保护率等评价EF-Tu和PFO对鸡坏死性肠炎的免疫保护作用。结果表明，攻菌前各组体重差异不显著，攻菌后PFO和EF组平均增重显著高于pcDNA组，血清中特异性抗体水平显著或极显著高于正常组与pcDNA组，攻菌后PFO和EF组肠道病变指数平均分显著和极显著低于pcDNA空载体组，小肠内产气荚膜梭菌定植量极显著低于pcDNA组。综合各指标表明EF和PFO真核表达质粒对鸡坏死性肠炎有良好的免疫保护作用，为开发研制新型抗产气荚膜梭菌疫苗提供了理论和实践基础。