目的皮肤创面修复是最古老的人类医学基础问题之一。体表慢性、难愈以及大面积创面对患者生活和工作质量造成了极大的危害,目前其治疗手段和疗效仍然是临床面临的一大挑战。随着对干细胞基础研究以及临床应用研究的深入,干细胞移植成为严重、慢性、难愈创面治疗的希望。然而,移植后到达创面干细胞活力下降,发生大量快速凋亡,严重地制约了这一技术在临床的应用。因此,增强移植干细胞存活及其抗凋亡能力,是提高干细胞移植治疗创面疗效的关键。干细胞预处理目前被公认为是最大程度地增强移植干细胞在损伤微环境存活的最佳方案。尽管H₂O₂是体内活性氧（ROS）之一,通常被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素,但低浓度H₂O₂却是作为细胞内第二信使,行使类似生长因子样的作用。本研究欲通过低浓度H₂O₂预处理干细胞,观察干细胞活力及抗氧化能力的改善及其相关机制,并进一步观察移植H₂O₂预处理干细胞在创面的存活以及对创面愈合的改善。方法1、分离、培养、鉴定小鼠BMSC。观察并鉴定BMSC的生长形态以及流式细胞术鉴定细胞特性;观察不同低浓度H₂O₂（0、25、50、100、150、200μmol/L）处理BMSC48h后细胞的增殖、生长的变化,以及对SDF-1及受体CXCR4和CXCR7表达的影响。2、BMSC经不同浓度H₂O₂（0、25、50、100、200μmol/L）刺激,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测PI3K、Akt、m TOR磷酸化蛋白表达;BMSC经PI3K抑制剂LY294002处理30min后,再经过或不经过低浓度H₂O₂（50μmol/L）预处理,分别用0、200、250、300和500μmol/LH₂O₂刺激24h,流式细胞术和Hoechst33342核染色检测细胞凋亡率,Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caps-3和Cleaved-Caps-3以及Akt、m TOR磷酸化蛋白等的表达。3、建立SD大鼠全层皮肤组织缺损伤模型,随机分为3组:生理盐水组（NS组）,单纯BMSC组（BMSC组）、H₂O₂预处理组（预处理BMSC组）。于大鼠背部中线靠颈侧制备直径1cm圆形全层皮肤缺损,经尾静脉注射Di I标记的BMSC,移植经50μmol/LH₂O₂预处理12h后的BMSC,观察各组干细胞在创面的募集和存活情况以及对创面愈合时间和质量的改善。结果1、25、50μmol/L低浓度H₂O₂作用于BMSC能有效促进细胞生长增殖。2、流式细胞分析结果显示,H₂O₂在200⁵00μmol/L高浓度范围内能显著诱导干细胞凋亡,并随着H₂O₂浓度的增加细胞凋亡率也增加,呈浓度依赖性;但如果BMSC经50μmol/LH₂O₂预处理12h后,再经200⁵00μmol/L的高浓度H₂O₂作用24h,发现与相应的未预处理组比较,经H₂O₂预处理各组细胞凋亡率明显降低,表明50μmol/LH₂O₂预处理可以降低高浓度H₂O₂所诱导的干细胞氧化应激性凋亡,提示低浓度H₂O₂预处理干细胞凋亡具有明显的保护作用。3、Wersten blot结果显示:与对照组比较,25、50μmol/LH₂O₂刺激BMSC12h后,对凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caps-3和Cleaved-Caps-3等的表达无影响;但将50μmol/LH₂O₂（作为信使分子）预处理细胞12h,在用高浓度300μmol/LH₂O₂刺激此细胞,则能抑制促凋亡蛋白Bax和Cleaved-Caps-3表达和促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达,提示低浓度H₂O₂预处理具有增强干细胞抗凋亡的作用。4、不同浓度H₂O₂处理BMSC12h后,对PI3K和Akt总蛋白表达无影响,但在25¹00μmol/L浓度范围内则上调PI3K和Akt磷酸化蛋白水平;其下游蛋白m TOR及其磷酸化蛋白表达均上调,提示低浓度H₂O₂刺激能活化PI3K/Akt/m TOR信号通路。5、细胞经50μmol/LH₂O₂预处理再暴露于高浓度300μmol/L浓度的H₂O₂作用24h,发现高浓度H₂O₂处理能明显抑制磷酸化Akt和m TOR以及Bcl-2蛋白的表达,上调Cleaved-Caps-3表达,而低浓度H₂O₂预处理则能对抗高浓度H₂O₂引起的这些蛋白表达变化,提示低浓度H₂O₂预处理通过活化Akt/m TOR信号通路,上调抗凋亡蛋白Bcl-2和抑制Cleaved-Caps-3表达,从而抑制凋亡发生,对干细胞产生保护作用。然而,PI3K抑制剂LY294002则能削弱这一保护作用。6、50μmol/LH₂O₂预处理干细胞移植治疗创面能明显延长干细胞在创面存活率,同时增强创面血管生存,提高创面愈合率,最终,H₂O₂预处理增强了移植干细胞在创面的存活和其修复再生潜能。结论H₂O₂预处理能显著增强骨髓间充质干细胞抗氧化应激损伤能力和促进创面愈合。