罗非鱼是原产于非洲的热带鱼类，现已成为世界性的主要养殖鱼类。在生产上，罗非鱼雄鱼比雌鱼生长快40-50％，因此提高罗非鱼雄性率具有重要实践意义。在各种罗非鱼杂交组合中，奥尼杂交鱼的雄性率最高，为95％，但根据染色体决定性别理论，其雄性率应为100％。由于鱼类的性别决定机制是多样的和易变的，较高等动物要复杂得多，因而通过分子生物学的研究从基因水平进行探讨，是一条揭示罗非鱼性别控制机理的好途径，为进一步提高罗非鱼雄性率奠定基础。本研究利用RT-PCR和RACE方法克隆了奥利亚罗非鱼的DMO和DMT基因，并对它们的表达特性进行了研究，这将有助于了解奥利亚罗非鱼的性别决定机制，从而采取人为控制措施，对奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼杂交产生全雄杂交后代的理论研究和生产实践具有重要意义。 利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法分别从奥利亚罗非鱼卵巢和精巢分离、克隆DMO和DMT基因，并进行序列测定与生物信息学分析。结果表明，DMO基因cDNA序列全长1571 bp[不含poly(A)]，包括148 bp 5’非翻译区，1230 bp阅读框以及含Poly(A)信号AATAAA的193 bp3’非翻译区[不包括Poly(A)]，阅读框共编码409个氨基酸，与尼罗罗非鱼DMO进行比较，同源性为96.3％，说明DMO在同物种间差别较小。而与尼罗罗非鱼，红鳍东方豚，虹鳟，青鲻，鼠，人等动物的DMRTl进行比较，同源性分别为：25.7％，25.8％，24.3％，29.7％，22.5％，22.0％。DMT基因cDNA序列全长1260 bp，包括74 bp 5’非翻译区，879 bp阅读框以及含poly(A)信号AATAAA的307 bp 3’非翻译区，阅读框共编码292个氨基酸。序列同源性分析表明，不同进化地位动物的DMRT1基因DM域编码序列存在高度同源性，显示DMRT1基因在系统进化上高度保守。生物信息学分析结果表明，DMO蛋白具有两个亲水性螺旋卷曲区域，97～112，155～168氨基酸区域，没有信号肽，含有两个跨膜结构域，发生跨膜运动。DMT蛋白不含螺旋卷曲区域，没有信号肽，是一个非跨膜的亲水性稳定蛋白，该蛋白以游离形式存在于细胞质内，不会发生跨膜运动。DMO和DMT包含两个相同的保守的功能结构域，分别行使性别调控，使DNA形成二聚体和结合回纹结构的功能。DMO和DMT都含有多个磷酸化位点，推测它们可能在细胞信号传导中发挥作用，且其生物活性可能接受信号途径中多种信号的调控。DMO蛋白N-端第1～5，41～51，65～67，86～89，98～110，154～170，183～203，205～248，258～264，284～291，293～298，270～375，389～392，402～410区域和DMT蛋白N-端第1～9，17～28，77～84，114～123，131～139，157～184，196～207区域可能是B细胞表位优势区域。DMO和DMT的高级结构相似，都含有两个a-螺旋区域。采用荧光定量RT-PCR方法，从mRNA水平对奥利亚罗非鱼DMO和DMT基因的时空表达谱进行了研究。结果发现，这两个基因均从原肠胚早期开始转录，一直到出膜，都维持着较高的表达水平，但DMO表达量明显高于DMT。鱼苗性腺分化时期，激素处理可显著提高奥利亚罗非鱼的雌、雄比率，还可影响DMO和DMT基因的表达量，提示它们可能与激素调控有关。在雌、雄鱼的肝和肾等5种组织中均检测不到这两个基因转录本的存在；在脑中仅可检测到DMO基因不同强弱的转录本，呈现出很强的中枢神经系统的表达特异性。此外，在成体的卵巢和精巢中分别只可检测到DMO和DMT基因的大量表达，显示二者在性别决定和分化中的重要功能。奥利亚罗非鱼DMO基因在其中枢神经系统发育及卵巢发生和功能维持上有着重要功能；DMT基因在精巢发生和功能维持上起重要作用。 为了进一步分析这两种基因mRNA在胞内的表达情况，利用原位杂交分析了奥利亚罗非鱼端脑、下丘脑、垂体、性腺、肝脏、心脏、脾脏、肾脏、肌肉等组织中DMO和DMTmRNA的表达情况，结果表明：DMO只在奥利亚罗非鱼的卵巢中表达；DMT仅在其精巢中表达。在奥利亚罗非鱼卵子发生中，DMO mRNA均匀分布于卵原细胞和各期卵母细胞的胞质中；在卵原细胞和Ⅰ、Ⅱ期卵母细胞中，随着卵母细胞的发育，DMO mRNA的杂交信号逐渐增强，最后充满整个胞质中。Ⅲ期卵母细胞中，DMO均匀分布在卵黄颗粒之间的细胞质中。Ⅳ期以上的卵母细胞胞质中，相对于前三个时期DMO mRNA的杂交信号明显减弱，整个胞质都呈现较淡的黄色，有向胞质外周皮质层迁移集中的趋势。当卵黄充满整个胞质之后，在整个卵母细胞中无DMO mRNA的杂交信号。在奥利亚罗非鱼精子发生中，DMT mRNA可在精原细胞和初级精母细胞中检测到。DMT mRNA的阳性信号在精原细胞中极为强烈，在初级精母细胞中较为微弱，而精子细胞中没有阳性信号。结果初步表明，奥利亚罗非鱼DMO和DMT基因对于生殖干细胞．卵原细胞和精原细胞的维持和正常功能可能起着重要作用。 为了进一步探讨奥利亚罗非鱼DMO和DMT的功能，本研究采用RT-PCR方法分别从奥利亚罗非鱼卵巢和精巢中克隆出DMO和DMT全长cDNA片断，构建了pMAL-c2x/DMO和pMAL-c2x/DMT重组质粒，成功地表达了DMO和DMT蛋白，发现在IPTG诱导4h后，目的蛋白可达到细菌总蛋白的50％左右。同时通过免疫印迹技术证明了这两种蛋白的免疫原性。经Xa切割、Aanylose-sepharose柱层析纯化后作为抗原免疫新西兰白兔制备了DMO和DMT多克隆抗体，并进行纯化。通过对纯化多抗进行Western blot分析，结果表明获得了高特异性的DMO和DMT抗体。 为了观察DMO和DMT在组织中的表达谱，首先，本研究制备了多种组织匀浆蛋白，使用纯化的抗体进行Westem blot分析，仅分别在卵巢和精巢中检测到DMO和DMT蛋白的表达；制备奥利亚罗非鱼多种组织切片，使用纯化的DMO和DMT多抗进行免疫组织化学分析，发现DMO仅在卵巢表达，而DMT仅在精巢表达，但其特异性低于原位杂交。以上结果有助于阐明DMO和DMT的功能及在鱼类性别调控中的作用。本研究首次从奥利亚罗非鱼中克隆到性别调控基因DMO和DMT，并分析了它们的表达特征及可能的功能。奥利亚罗非鱼DMO和DMT基因的成功克隆及分子生物学特征和功能分析不仅为DMRT基因的分子进化和相似性比较研究提供了新的材料，而且对于进一步研究鱼类性别调控及DMRT基因的结构和功能有着重要的理论价值和研究前景。