目的:糖尿病视网膜病(DR)和早产儿视网膜病(ROP)都属于血管新生性视网膜疾病，此类疾病已经日渐成为世界范围内最主要的致盲性眼病，目前缺乏有效的治疗措施和药物。鼓槌石斛是2010版中国药典收载中药石斛中的一种，石斛传统记载具有明目的功效，但是其明目的药效物质基础和机理都不是很清楚。本研究主要在体内动物和体外细胞实验上，观察鼓槌石斛乙醇提取物(DC)及其鼓槌石斛中的主要活性成分毛兰素(Erianin)对糖尿病视网膜病和早产儿视网膜病的改善作用，并从调控视网膜血管新生和炎性损伤的角度深入研究DC和Erianin改善糖尿病视网膜病活性的机理。　　方法:　　1.采用STZ诱导小鼠或大鼠Ⅰ型糖尿病，并在此基础上诱发糖尿病视网膜病，包括增殖性糖尿病视网膜病(PDR)和非增殖性糖尿病视网膜病(NPDR)。在此基础上，给予药物DC和Erianin进行干预。　　2.将新出生7天的小鼠置于75.5％氧分压环境中5天，再返回正常氧环境中5天，通过高氧-相对低氧过程诱导新生小鼠视网膜血管发生消退并进而出现异常增生的过程，从而建立氧诱导新生小鼠视网膜病动物模型。在此基础上，给予药物DC和Erianin进行干预。　　3.运用视网膜血管CD31免疫荧光染色和视网膜HE染色观察动物视网膜组织中的血管新生情况。　　4.通过检测视网膜组织中伊文思蓝(Evans blue)的渗漏来检测血-视网膜屏障的破坏情况。　　5.采用Real-Time PCR实验检测视网膜组织中促血管新生、炎性相关基因和紧密连接蛋白基因的表达。　　6.采用蛋白电泳Western-Blot检测视网膜组织中促血管新生、炎性相关蛋白和紧密连接蛋白的表达。　　7.采用ELISA实验检测动物血清和玻璃体腔中VEGF含量，以及动物血清中IL-1β、IL-6、TNFα、TF、Serpine1的含量。　　8.通过视网膜组织免疫荧光染色实验检测视网膜组织中紧密连接蛋白occludin、 claudin-1的表达。　　9.视网膜内皮细胞RF6A或小胶质细胞BV-2先加入Erianin(10、50 nM)处理后，再加入高浓度葡萄糖(25 mM)。采用蛋白电泳和Real-Time PCR实验检测Erianin对调控血管新生相关HIF-1α-VEGF-VEGFR2信号通路蛋白和基因表达的影响。　　10.RF6A细胞先加入Erianin(5、10、25、50 nM)处理后，再加入VEGF(10 ng/ml)。采用蛋白电泳检测Erianin对VEGFR2的磷酸化激活，以及其下游cRaf-MEK1/2-ERK1/2和PI3K-AKT-mTOR-P70S6 kinase信号通路激活的影响。　　11.BV-2细胞先加入Erianin(10、50 nM)处理后，再加入高浓度葡萄糖(25 mM)。采用蛋白电泳和Real-Time PCR实验检测Erianin对调控炎性损伤相关NFκB、Egr-1信号通路的影响。　　结果:　　1.STZ诱导C57小鼠的PDR发生于糖尿病病程5月龄时。糖尿病5月龄小鼠视网膜内新生血管明显，促血管新生相关基因VEGF、VEGFR1、VEGFR2、MMP2、MMP9的表达明显上升。　　2.DC(30、300 mg/kg)及Erianin(1、10 mg/kg)均可以明显降低PDR小鼠视网膜内增加的血管数量;降低PDR小鼠视网膜内HIF-1α、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的基因表达;同时降低PDR小鼠血清及玻璃体腔中VEGF的含量。　　3.深入研究Erianin抑制视网膜血管新生的机理发现:高浓度葡萄糖(25 mM)可以分别诱导视网膜血管内皮细胞RF6A和神经小胶质细胞BV-2中HIF-1α的转核激活，上调VEGF及其受体VEGFR1、VEGFR2的基因表达，增加VEGF蛋白的表达，但是Erianin(10、50 nM)能够显著的抑制上述过程;同时在视网膜血管内皮细胞RF6A上，我们发现Erianin能够抑制VEGF(10ng/ml)诱导的VEGFR2磷酸化激活，并进一步抑制其下游cRaf-MEK1/2-ERK1/2和PI3K-AKT-mTOR-P70S6 Kinase信号通路的激活。　　4.Evans blue渗漏检测实验显示，DC(30、300 mg/kg)能够明显改善STZ诱导的大鼠糖尿病视网膜病引起的血-视网膜屏障的破坏;DC(30、300 mg/kg)及Erianin(1、10 mg/kg)亦能够明显改善STZ诱导的小鼠糖尿病视网膜病引起的血-视网膜屏障的破坏，这些作用都呈现剂量依赖性。　　5.深入研究DC改善NPDR的机理发现:Real-Time PCR、蛋白电泳和视网膜组织免疫荧光染色实验都显示DC(30、300 mg/kg)能够明显逆转NPDR大鼠视网膜组织中降低的紧密连接蛋白occludin和claudin-1的表达;DC(30、300 mg/kg)可以降低NPDR大鼠视网膜组织中增加的ICAM-1，以及磷酸化NFκBp65、IκB、IKK的表达;同时DC还能降低NPDR小鼠血清和视网膜组织中升高的IL-1β、IL-6、TNFα、Egr-1、TF、Serpine1的表达。　　6.深入研究Erianin改善NPDR的机理发现:Erianin能够抑制高浓度葡萄糖(25mM)刺激的BV-2细胞内NFκB信号通路的激活，包括抑制NFκBp65、IκB、IKK的磷酸化激活，抑制NFκBp65的转核，抑制炎性因子IL-1β、IL-6、TNFα的基因表达;Erianin还能够抑制高浓度葡萄糖(25 mM)刺激的BV-2细胞内Egr-1信号通路的激活，包括抑制Egr-1转核，抑制Egr-1、TF、Serpine1的基因表达。　　7.采用高氧-相对低氧成功建立了氧诱导新生小鼠视网膜病模型(OIR)。OIR小鼠视网膜中心区域呈现大片无灌注区，周围区域出现明显血管新生过程。OIR小鼠视网膜组织中促血管新生相关VEGF、VEGFD、VEGFR1、VEGFR2、PDGFA、PDGFB、PDGFRa、PDGFRb、MMP2、MMP9的基因表达明显上调，氧化应激相关Nrf2、GCLC、GCLM的基因表达则明显下调。　　8.DC(50、200 mg/kg)能够改善OIR小鼠血管新生的程度，包括降低视网膜周围区域血管密度和微血管瘤程度，血管肿胀变形迂曲程度也有所减弱，并可见无灌注区沿放射状动脉上血管芽形成也减少。Erianin(20、50 mg/kg)也能够改善OIR小鼠视网膜血管新生程度和血管形态，包括降低周围区域血管密度，减轻血管肿胀迂曲和微血管瘤程度。此外，Evans blue渗漏实验显示DC(50、200 mg/kg)和Erianin(20、50 mg/kg)均能够明显缓解OIR小鼠血-视网膜屏障的损坏。　　9.深入研究Erianin改善OIR药效活性机理发现:Erianin能够降低OIR引起的视网膜中促血管新生相关基因表达上调情况，包括VEGF、VEGFR1、VEGFR2、PDGFA、PDGFB、PDGFRa、PDGFRb、bFGF、MMP2;同时逆转OIR引起的视网膜紧密连接蛋白基因表达的下降，包括occludin、claudin-5、Tjp1。　　结论:　　1.DC及Erianin通过降低促血管新生因子VEGF的表达，抑制了视网膜血管新生，从而改善了PDR的进程。深入研究Erianin改善PDR的机理发现它可以抑制视网膜血管内皮细胞和神经小胶质细胞中HIF-1α的转核，从血管内皮细胞自分泌和小胶质细胞旁分泌两个方面抑制了VEGF的表达，并在内皮细胞上抑制了VEGF诱导的VEGFR2及其下游cRaf-MEK1/2-ERK1/2和PI3K-AKT-mTOR-P70S6 Kinase信号通路的激活，从而达到抑制视网膜血管新生，改善PDR的药效活性。　　2.DC及Erianin通过抑制炎性损伤，缓解血-视网膜屏障的损坏，达到改善NPDR的药效活性。深入研究Erianin改善NPDR的机理发现它一方面抑制了炎性相关NFκB和Egr-1信号通路的激活，降低了炎性因子的水平，进而减缓炎性损伤，另一方面通过增加降低的紧密连接蛋白表达，进而保护BRB，缓解了NPDR的进程。　　3.DC及Erianin具有改善OIR药效活性，包括减缓OIR病程中视网膜血管新生和血管渗漏。Erianin通过抑制OIR视网膜中促血管新生相关基因的表达，逆转减少的视网膜紧密连接蛋白的表达，从而改善OIR的病程。