幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是目前发现唯一能够在人胃内定植、生存的微需氧革兰氏阴性杆菌。Hp是世界性分布的病原菌，它的感染是目前人类发生率最高的慢性细菌感染之一。现已确认，Hp感染是消化性溃疡和慢性胃炎的重要病因，并与胃癌和胃淋巴瘤的发病密切相关，流行病学调查发现Hp感染还与冠心病、糖尿病、支气管炎等关系密切。因此，研制有效的预防和治疗疫苗来预防控制Hp感染，不失为一种简便、经济、高效的途径。黏附素(HpaA)是暴露于Hp细菌表面的鞭毛鞘膜蛋白，也是该细菌主要的粘附因子之一，其核苷酸和氨基酸序列高度保守，能使Hp紧密粘附于胃上皮细胞。np感染病人血清中出现的HpaA抗体能与HpaA蛋白发生免疫反应。Hp基因组中含有34个功能未明的外膜蛋白基因，一些实验研究表明，部分外膜蛋白分子具有良好的免疫活性，其中Hp外膜蛋白Omp22，已有研究表明其能够分泌表达于细菌表面，并能引起Th1细胞较高的免疫反应，有可能成为幽门螺杆菌疫苗研究的良好免疫候选抗原。Hp疫苗研究已取得了一定成绩，但一直令学者们遗憾的是单一抗原成分免疫动物时，获得的保护率均不理想，为了克服单种抗原免疫性较弱的不足，有学者建议将多种抗原成分联合起来制作疫苗，增强免疫效果、提高免疫保护率。本课题研究旨在对临床分离株Hp MEL-HP27的omp22基因和hpaA基因进行克隆，并通过氨基酸接头构建omp22-hpaA融合基因，生物信息学软件分析两个基因融合前后所表达蛋白的生物学特性；分别构建表达omp22、hpaA及其融合基因的原核表达系统，对表达蛋白进行纯化和免疫原性鉴定；通过动物实验评价所表达蛋白作为Hp疫苗抗原的免疫保护效果，为筛选高效的Hp疫苗研究奠定基础。实验方法1．幽门螺杆菌omp22、hpaA基因克隆和生物信息学分析及其融合基因的构建采用PCR方法，以本研究室从郑州胃炎患者胃部分离的Hp菌株MEL-HP27的染色体DNA为模板，扩增出omp22、hpaA基因片段，分别将他们插入克隆载体pBlueScriptⅡSK(-)，转化大肠杆菌，经酶切和特异PCR方法鉴定出阳性重组载体，对插入目的片段进行测序。应用分子生物学软件Omiga2.0和DNAstar对Hp MEL-HP27的Omp22、HpaA蛋白的生物化学特性进行分析，预测他们的柔韧性和细胞表位区域，并预测Omp22、HpaA和Omp22-HpaA的二级结构、疏水性、抗原性等，比较两基因融合前后的变化，选择合适的氨基酸接头。去除omp22基因的终止密码子和hpaA基因的起始密码子，以重叠延伸PCR方法扩增出带柔韧接头编码序列的融合基因omp22-hpaA，对重组质粒进行测序鉴定。2．幽门螺杆菌omp22、hpaA和omp22-hpaA融合基因原核表达载体的构建及工程菌蛋白表达条件的初步优化分别将omp22、hpaA和omp22-hpaA从克隆载体中双酶切后，回收目的DNA片段插入原核型表达载体pMAL-c2X，构建目的蛋白基因与大肠杆菌麦芽糖结合蛋白基因融合表达的重组质粒，转化大肠杆菌TB1感受态细胞，氨苄青霉素抗性、蓝-白斑试验筛选阳性克隆，限制性内切酶酶切及特异PCR鉴定出阳性重组质粒。采取不同的诱导时机、诱导剂浓度、诱导时间等条件诱导重组菌表达，表达产物处理后经SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白在不同条件下的表达水平，选择目的蛋白适宜的表达条件。3．Omp22、HpaA和Omp22-HpaA融合蛋白的纯化及其免疫学活性研究选取适宜条件对重组菌进行大量诱导，诱导表达产物经超声粉碎，超声上清经初步盐析后，应用直链淀粉亲和层析柱进行纯化，Western blot鉴定目的蛋白纯化前后的免疫反应性。凝胶扫描法分析蛋白质纯度(SynGene，USA)，Bradford法测定蛋白质含量。用纯化的Omp22、HpaA、Omp22-HpaA和Hp菌体抗原免疫小白鼠获得免疫血清，用制备免疫血清与重组蛋白进行Western blot反应，检测重组蛋白的免疫学活性。4．幽门螺杆菌外膜蛋白Omp22、黏附素HpaA和Omp22-HpaA融合蛋白免疫保护作用的动物实验研究以纯化的Omp22、HpaA、Omp22-HpaA、UreB为抗原，大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63为黏膜佐剂，经口免疫昆明小鼠，每周1次，共免疫4次，并设立免疫佐剂和PBS对照组。末次免疫1周后，各组小鼠均用新鲜培养的Hp(NCTC11637)进行攻击感染，共攻击感染2次，间隔10h。末次攻击2周后处死小鼠，取小鼠胃组织分别作尿素酶定性试验和半定量试验、Hp培养、涂片Gram’s染色镜检和组织学检查，检测免疫接种对Hp在小鼠胃内定植的影响，评价重组抗原与佐剂组合的免疫保护效果。5．统计学分析应用SAS 9.13统计分析软件包进行实验数据分析。计量资料的比较采用单因素方差分析，均数间两两比较采用最小显著差异法(Least significant deviation，LSD)，计数资料分析采用X~2检验或Fisher’s确切概率法，检验标准以P＜0.05为差异有显著性。结果1．幽门螺杆菌omp22基因、hpaA基因克隆和omp22-hpaA融合基因构建克隆载体酶切和测序结果显示，Hp omp22、hpaA基因和omp22-hpaA融合基因成功克隆到质粒pBlueScriptⅡSK(-)中；其中接头序列GGTGGAGGC已成功地插入omp22-hpaA融合基因中，且整个融合基因阅读框正确。MEL-HP27 omp22基因编码区长度为540bp，编码由179个氨基酸残基组成的肽链，其序列已被GenBank收录(基因号：DQ499023)，与GenBank中公布的三株幽门螺杆菌KCTC0217BP、26695、J99的相应基因序列及编码产物进行比较，核苷酸同源性在93.84％～97.41％之间，氨基酸序列在90.50％～97.46％；hpaA基因编码区长度为783bp，编码由260个氨基酸残基组成的肽链，该基因序列已被GenBank收录(基因号：DQ353891)，与GenBank公布的8株Hp hpaA序列进行同源性分析，核苷酸序列同源性在94.64％～97.07％，氨基酸同源性高达95.00％～97.31％。生物信息学分析结果显示Omp22、HpaA蛋白和融合后Omp22-HpaA蛋白的亲水性、抗原性等未发生变化，两蛋白融合前后亲水性、抗原性基本一致，抗原活性区具有较好的柔韧性和亲水性；融合蛋白Omp22-HpaA和融合前单体蛋白Omp22、HpaA的二级结构十分相似、未发生结构上的变化；可推测Omp22和HpaA蛋白融合前后的抗原性相一致，进一步说明通过柔韧氨基酸接头连接omp22和hpaA基因没有影响融合蛋白的二级结构和抗原性。2．幽门螺杆菌omp22、hpaA和omp22-hpaA融合基因原核表达载体的构建及工程菌蛋白表达条件初步优化通过DNA重组技术分别构建了omp22、hpaA和omp22-hpaA融合基因的原核高效表达系统pMAL-c2X-omp22-TB1、pMAL-c2X-hpaA-TB1、pMAL-c2X-omp22-hpaA-TB1。分别对诱导时机、诱导剂浓度、诱导时间主要诱导条件初步优化，选择了目的蛋白适宜的表达条件分别为：在omp22、hpaA重组菌生长2h时加入终浓度为0.3mM的诱导剂IPTG诱导4h目的蛋白表达量最高，分别约为25％和30％；omp22-hpaA重组菌生长2h时加入终浓度为0.4mM的诱导剂IPTG诱导7h目的Omp22-HpaA蛋白表达量高于20％。3．Omp22、HpaA和Omp22-HpaA融合蛋白的纯化及其免疫活性研究结果Omp22、HpaA和Omp22-HpaA重组菌在表达适宜条件下培养诱导，表达产物经超声波破碎后，上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，用Genetools软件分析目的蛋白均有一定的比例以可溶性形式表达于细胞间质中。经直链淀粉亲和层析预装柱分离纯化后的重组蛋白的纯度均达到了90％以上。Western blot结果显示，三种重组蛋白均能够被相应的小鼠免疫血清和小鼠抗Hp菌体抗原血清、Hp感染病人血清所识别。证明本研究成功构建了Hp的omp22、hpaA和omp22-hpaA融合基因的原核表达系统表达的重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。4．幽门螺杆菌外膜蛋白Omp22、黏附素HpaA和Omp22-HpaA融合蛋白免疫保护效果纯化rOmp22、rHpaA、rOmp22-HpaA、rUreB联合黏膜免疫佐剂mLT63经口免疫小鼠，Hp攻击感染后，采用尿素酶定性试验和半定量试验、Hp培养、涂片Gram’s染色镜检和组织学检查方法评价免疫保护效果。研究结果发现各抗原实验组与黏膜免疫佐剂和PBS对照组之间保护率差异具有统计学意义，均高于黏膜免疫佐剂和PBS对照组；各实验组之间保护率差异不具有统计学意义，其中rOmp22组免役保护率46.67％(7／15)，rHpaA组免疫保护率53.33％(8／15)、rOmp22-HpaA组免疫保护率71.43％(10／14)、rUreB组免疫保护率60％(9／15)，提示rOmp22、rHpaA、rOmp22-HpaA和传统rUreB抗原免疫保护效果相当。实验证明了rOmp22、rHpaA和rOmp22-HpaA融合蛋白能够显著减少Hp的定植，产生了一定的免疫保护作用，为研究幽门螺杆菌疫苗筛选免疫保护性蛋白提供了有意义的依据。结论1．从Hp郑州分离株MEL-HP27基因组DNA中成功克隆到外膜蛋白omp22基因，该基因已被GenBank收录，基因编号为DQ499023，是中国向GenBank提交的第一个omp22基因序列，也是GenBank第四个收录的Hp omp22基因；同时还克隆到MEL-HP27黏附素hpaA基因，该基因已被GenBank收录，基因编号为DQ353891。2．采用重叠延伸PCR方法，通过柔韧氨基酸接头连接成功构建了omp22-hpaA融合基因，有效地保持Omp22、HpaA单体蛋白原有的抗原活性中心和生物学活性。3．利用基因重组技术构建了omp22、hpaA和omp22-hpaA融合基因的原核表达系统pMAL-c2X-omp22-TB1、pMAL-c2X-hpaA-TB1、pMAL-c2X-omp22-hpaA-TB1，能够稳定高效表达重组蛋白rOmp22、rHpaA和rOmp22-HpaA。4．纯化的重组蛋白rOmp22，研究发现具有良好的免疫原性和免疫反应性，为研究幽门螺杆菌疫苗发现新的有价值的候选抗原提供了有意义的依据。5．制备的重组蛋白rHpaA、rOmp22-HpaA纯度高、并具有良好的免疫原性和免疫反应性，可以作为发展Hp基因工程亚单位疫苗的候选组分和免疫检测诊断候选抗原。6．应用小鼠动物模型，研究评价了rOmp22、rHpaA、rOmp22-HpaA、rUreB和rOmp22、rHpaA两种抗原单纯混合后联合黏膜免疫佐剂经口免疫小鼠的免疫保护效果。